Annotare i geni
5’
3’
Gene xxxx
3 esoni
proteina y
Gene zzzz
7 esoni
proteina w
Il primo passo...

Abbiamo la sequenza completa del
DNA di un organismo:




Quanti geni contiene in tutto?
Dove sono localizzati i geni?
A cosa serve ciascun gene (ovvero,
qual è la funzione della proteina
codificata, ammesso che effettivamente
codifichi per una proteina)?
Quali sono gli splicing alternativi più
comuni di ciascun gene?
“Annotare” i geni

Dato un genoma, servono altri due
elementi:


mRNA e proteina
Tre indizi fanno una prova:



Conosciamo la proteina (la abbiamo
“vista” e sequenziata)?
Conosciamo il trascritto che codifica per
la proteina (lo abbiamo sequenziato)?
Conosciamo il gene che produce il
trascritto (abbiamo sequenziato la
regione corrispondente del genoma)?
Leggere le sequenze



Ovviamente, è possibile determinare
anche la sequenza di un trascritto
(mRNA), e, con diverse tecniche,
anche quella di una proteina
Quindi, se conosco la sequenza di
un mRNA, posso localizzare lungo la
sequenza genomica la regione che
lo produce (e - a tratti - uguale al
trascritto!)
Se conosco anche la sequenza della
proteina codificata, allora ho
completato la annotazione del gene
Leggere le sequenze

Attenzione, però: mentre il DNA è “statico”,
e quindi la sua sequenza è presente nella
stessa forma in tutte le cellule, lo stesso
non vale per gli RNA:


NON tutti i geni sono trascritti in tutte le cellule
A seconda di



Stadio di sviluppo
Tipo di tessuto/cellula
Stimoli esterni
Possono variare i geni trascritti e i relativi
splicing alternativi
 Morale: mentre abbiamo sequenze di
genomi completi, non siamo ancora sicuri
di avere trascrittomi (e proteomi) completi
anche per gli organismi più studiati!
Annotare i geni
mRNA
DNA
(doppio
filamento)
Annotare i geni

Quindi, se abbiamo la sequenza
del DNA di un organismo
possiamo:
Prendere le sequenze di tutti i
trascritti che conosciamo
 Cercare regioni su uno dei due
filamenti che sono uguali al
trascritto “a pezzi”
 Queste regioni sono... i “geni”!

Un gene, schematicamente
3’
5’
3’
5’
Il trascritto (mRNA) è costituito dalla giunzione dei
tratti corrispondenti ai rettangoli (esoni), per
i quali si trova una corrispondenza ESATTA su
uno dei due filamenti del DNA
Gli introni
sono sul DNA
ma non nel trascritto
Sul DNA, gli esoni sono inframmezzati da parti di
sequenza che non sono contenuti nell’mRNA, gli introni
Le frecce indicano di quale dei due filamenti
il trascritto è una copia esatta
Un gene, schematicamente
3’
5’
3’
5’
Il trascritto (mRNA) è costituito dalla giunzione dei
tratti corrispondenti ai rettangoli (esoni), per
i quali si trova una corrispondenza ESATTA su
uno dei due filamenti del DNA
Gli introni
sono sul DNA
ma non nel trascritto
Sul DNA, gli esoni sono inframmezzati da parti di
sequenza che non sono contenuti nell’mRNA, gli introni
Le frecce indicano di quale dei due filamenti
il trascritto è una copia esatta
Un gene in un computer
Tre esoni: il gene è localizzato sul filamento
“antisenso” (quello sotto), detto anche
“negativo” (il gene si annota sul filamento che
contiene la copia esatta dell’mRNA)
I “Browser” genomici


Come dice il nome stesso, sono
strumenti che permettono ai
ricercatori di “navigare” all’interno dei
genomi di cui si conosce la
sequenza, visualizzando tutte le
annotazioni che sono disponibili
Sono accessibili via internet:


genome.ucsc.edu (University of
California Santa Cruz - sito di riserva secondo sito di riserva)
www.ensembl.org (sviluppato da EMBLEBI e dal Sanger Center)
Le Coordinate Genomiche






In ogni sequenza nota, gli elementi che la
compongono sono numerati da 1 fino
all’ultimo
Sia le sequenze nucleotidiche che quelle
aminoacidiche sono orientate
I nucleotidi si leggono da 5’ a 3’
Gli amminoacidi si leggono da N
(terminale) a C (terminale)
Quindi, anche tutti i cromosomi di una
specie sono numerati da 1 in poi
Ciascun paio di basi in un genoma è
definito da due coordinate:



Numero di cromosoma
Posizione all’interno del cromosoma
I browser mostrano uno dei due filamenti
del DNA, ed (implicitamente) anche l’altro
Cliccando uno
dei due link si
accede al browser
Scelgo
il gruppo
Scelgo
la specie
“versione”
tratto da
visualizzare
VIA!
“pulsanti” per muoversi
lungo il cromosoma
“pulsanti” per avvicinare
(zoom in) o allontanare
(zoom out) la visuale
“RefSeq” - trascritti
“rappresentativi
del gene (all’epoca di
un gene-un trascritto)
UCSC Known Gene
- idem, ma annotati
dai curatori del sito
Un solo gene, con tanti
piccoli esoni ed intoni
molto più ampi
In più di
300000 paia di basi
Ricerca per coordinate

Tornate alla pagina iniziale, e
mantendendo le stesse
selezioni di prima, provate ad
inserire queste coordinate:
chr7:155,288,319-155,297,728
(potete copiare ed incollare)
Si viene portati alla regione genomica corrispondente.
Tutti i trascritti “mappati” sul genoma sono cliccabili:
cliccandoci sopra è possibile cambiare
la modalità di visualizzazione e/o accedere a tutte le
informazioni disponibili sul gene in questione
Se provate a cliccare sulla “riga” nera sotto “Human mRNA
from GenBank”....
.... si scopre che ci sono tanti trascritti che provengono
da questa regione, non solo uno... e in particolare
i diversi trascritti “condividono” alcuni esoni, altri no 
splicing “alternativi”
... riassumendo...
Ricerca per parole chiave



Procedendo come si è visto, è possibile
esplorare i diversi genomi disponibili
Ma: è possibile utilizzare la casella
“coordinate” per effettuare una ricerca per
parole chiave
Ad esempio, si può cercare un gene, dato il
nome
Lunga lista di risultati, tipo “google”... ma se guardiamo con attenzione
c’è un gene che si “chiama” shh sia nella lista “known” che nella
lista RefSeq. Cliccando sul link corrispondente...
... si ritorna dove eravamo prima!
Annotare bioinformaticamente
i geni


Il genome browser permette anche di
trovare la corrispondenza trascritto
regione genomica come si era visto in
precedenza
Nella barra blu in cima alla pagina, cliccate
su “Blat”
Selezionate
il genoma che
vi interessa
“BLAT”
Incollate la
sequenza
da cercare
“Blat”

Provate a copiare e incollare la
sequenza 1 che trovate alla
pagina del corso
Come si può vedere, la vostra sequenza “mappa” in diverse regioni del
genoma, su diversi cromosomi; per ogni risultato l’interfaccia vi indica
da dove a dove è stata trovata corrispondenza per il trascritto (START-END)
Quello che ci interessa, per ora, è il “match” che copre tutto il trascritto,
con identità del 100%, ovvero il primo risultato. Cliccando sul link “browser”
corrispondente, si viene mandati...
Questa è la vostra
sequenza mappata sul
genoma
“Blat”


E’ possibile inserire nella casella di
ricerca anche la sequenza di una
proteina (sequenza 2 della pagina)
L’interfaccia cercherà una regione
genomica che - spezzettata in esoni
ed introni - tradotta tripletta per
tripletta codifica per la proteina che
avete sottomesso
Come si può vedere, in questo caso la proteina è andata a “cadere” in una
regione dove è già annotato un gene, con il trascritto corrispondente. Però,
stavolta, la regione “coperta” dalla proteina è più corta di quella coperta dal
trascritto... come mai?
E... come mai sono state trovate altre due regioni in cui,
almeno parzialmente, è stata trovata corrispondenza per la proteina?
Cliccando sul link in corrispondenza del secondo risultato..
In questo caso, siamo andati a finire in una regione (e su un cromosoma!)
completamente differente... eppure nella regione è annotato un gene,
che tradotto a triplette codifica per qualcosa di simile alla nostra proteina
di partenza, e le regioni corrispondenti cadono proprio sugli
esoni del gene…
“BLAT”


Terzo esperimento: sempre
partendo dalla proteina,
nell’interfaccia di “BLAT”
selezioniamo il genoma del topo
Cosa succederà, confrontando
una proteina umana “contro” il
genoma del topo?
Compaiono ben 6 (!) regioni di corrispondenza... notate in particolare che le
prime tre coprono regioni abbastanza ampie della proteina, con un’alta
percentuale di identità.
Cliccando su “browser” in corrispondenza del primo risultato...
... andiamo a cadere proprio in corrispondenza di un gene di topo... la proteina
sembra anche coprire tutto il trascritto!
Quindi, apparentemente, nel genoma del topo c’è un gene che codifica per una
proteina che “assomiglia” a quella dell’uomo?
Andiamo a riprendere il primo risultato dell’uomo
TOPO
UOMO
I due
geni sono localizzati su due cromosomi diversi
(topo - 5, uomo 7)... ma:
Hanno tutti e due 3 esoni
... e qualcuno ha dato lo stesso nome (Shh) sia al gene
dell’uomo che a quello del topo...
“BLAT”


Ora effettuiamo il procedimento
inverso: a partire dalla proteina
del gene SHH di topo, andiamo
a mapparla sul genoma umano
Selezionate “Blat”, e “Human”
come organismo
Ancora tre risultati.... e cliccando sul primo...
.... si ritorna al gene chiamato “shh” dell’uomo!
Provando a ritornare indietro, selezionando stavolta
il secondo risultato..
... ritroviamo l’IHH, che era stato il secondo “match” di
quando avevamo utilizzato la proteina dell’uomo contro
il genoma dell’uomo...
.... morale.....
Partendo da…..
SHH UOMO
Trovo…..
SHH TOPO
SHH UOMO
SHH TOPO
IHH UOMO
IHH TOPO
DHH UOMO
DHH TOPO
... e gli altri animali?


Proviamo, sempre con BLAT, a
selezionare una specie
evolutivamente più lontana,
utilizzando la proteina
dell’uomo..
.... proviamo con la Drosophila!
In questo caso, la regione che corrisponde alla nostra proteina è molto più
piccola, ed è più piccolo anche il frammento di proteina che riusciamo a
fare corrispondere...
Eppure, c’è una corrispondenza con un gene della Drosophila, che cade
esattamente su un esone (e, non a caso, il gene si chiama “hh”....)
L’evoluzione al lavoro
milioni
di anni
fa
Oggi
HH Drosophila
SHH
DHH uomo
IHH
HH
Duplicazione
Duplicazione
Ad ogni duplicazione
compare un nuovo “HH”
Speciazione uomo/topo
SHH
DHH topo
IHH
I geni omologhi




A questo punto, si può ipotizzare che i vari
geni “simili” tra loro che troviamo nelle
diverse specie, lo siano perché “parenti”,
ovvero discendenti dallo stesso/i gene/i in
specie antenate (speciazione) o nella
stessa specie (duplicazione)
Due sequenze (sia DNA, sia RNA, sia
proteine) per cui possiamo fare questa
ipotesi – basandoci sulla loro similarità –
sono dette sequenze omologhe
Quindi l’SHH dell’uomo è omologo
dell’SHH di topo e dell’HH della Drosophila
Ma anche l’IHH dell’uomo è omologo di
SHH dell’uomo, in quanto duplicati dello
stesso gene di partenza
Omologhi: ortologhi e
paraloghi

Per complicare un po’ la
nomenclatura: due sequenze
omologhe sono dette




Ortologhe, se sono in specie diverse
Paraloghe, se sono nella stessa specie
Esempio: SHH topo è ortologo a
SHH dell’uomo; DHH uomo è
ortologo a DHH del topo e paralogo
a IHH e SHH dell’uomo
Sulla base della similarità riusciamo
anche a ipotizzare se si sia verificata
prima una duplicazione o una
speciazione
Omologhi e paraloghi



SHH uomo è più simile a SHH topo
che a IHH e DHH uomo
Quindi, gli eventi di duplicazione
sono più lontani nel tempo rispetto
all’evento di speciazione uomo/topo
Ma: considerando ad esempio i geni
dell’uomo, quanto è comune trovare
ortologhi in altre specie? L’uomo ha
dei geni “propri”?
I geni dell’uomo e di altre
specie




Per la quasi totalità dei geni dell’uomo si
trova un ortologo negli altri mammiferi
(inclusi quelli tessuto-specifici, che
“caratterizzano” particolari tipi di cellula)
Per la quasi totalità dei geni dell’uomo si
trovano ortologhi in altri vertebrati (ci
possono essere più o meno duplicati nelle
diverse specie)
Per buona parte dei geni dell’uomo si
trovano ortologhi in altre specie animali
(inclusi, ad esempio, gli invertebrati come
gli insetti)
Per i geni “di base” responsabili del
“funzionamento” delle diverse cellule si
riescono a trovare ortologhi negli eucarioti
più semplici (unicellulari come il lievito), o
addirittura nei procarioti come i batteri
Usare i geni ortologhi




Oltre che per studi evolutivi, l’ortologia di
geni in specie diverse può servire anche
allo studio di uno o più geni
Se non conosco la funzione di un gene
umano, posso cercarne l’ortologo in topo e
studiarlo lì (più “pratico” sperimentalmente)
Annotazione: se ho un gene “mancante” in
una specie, posso cercare di localizzarlo
basandomi su geni di altre specie
Ovvero, posso cercare di annotare un gene
in mancanza di “indizi” (trascritto e/o
proteina) basandomi sulle sequenze di
altre specie  se c’è una data proteina in
topo mi posso aspettare che – da qualche
parte – nel genoma dell’uomo ci sia un
gene che codifica per qualcosa di simile
Annotare i geni con pochi
indizi

Manca la proteina:
Posso utilizzare appositi
programmi che predicono le
possibili traduzioni di un trascritto
in proteina
 Verifico se in specie vicine a
quella che sto studiando sono
annotate (possibilmente,
sperimentalmente) proteine simili
a quella che ho predetto

Annotare i geni con pochi
indizi

Manca il trascritto


Così come abbiamo fatto con la
proteina di SHH, è possibile
cercare nel genoma regioni che
tradotte (e concatenate)
producono la proteina stessa
E se mancano sia il trascritto
che la proteina?
Annotare i geni con pochi
indizi



Basandoci sul principio “specie simili
hanno più o meno gli stessi geni” possiamo
- data una proteina di una specie - cercare
una regione del genoma che codifica per
qualcosa di simile (così come quando
avevamo confrontato una proteina di uomo
con il genoma del topo, e viceversa)
Procedura “tipica” per genomi come quello
del cane, del gatto, dell’opossum (di cui ho
la sequenza genomica, ma pochi trascritti)
Ma: potrebbero esistere geni “fantasma”
mai visti in nessuna specie (e quindi non
riscontrabili con l’approccio comparativo?)