Purificazione e
caratterizzazione delle
proteine
Purificazione e caratterizzazione delle proteine
• Purificazione:
– Cromatografia
– Elettroforesi
• Caratterizzazione:
– Massa molecolare
– Struttura primaria
– Struttura secondaria
– Folding/Unfolding
– Struttura terziaria
Purificazione delle proteine
Precipitazione delle proteine
• Globuline: Carica elettrica uniformemente
distribuita. Precipitano per salting out (effetto
cosmotropico)
• Albumine: Carica elettrica disomogenea.
Aggregano in assenza di controioni.
Precipitano per salting out (effetto
cosmotropico)
Precipitazione delle proteine
• Salting out (effetto cosmotropico), es.
(NH4)2SO4
• Solventi (acetone freddo, acetone + acido)
• Denaturazione termica
Purificazione delle proteine
Gel filtrazione
• L’interazione avviene tra la proteina e
la matrice polimerica.
• La matrice polimerica è fatta di
microsfere con porosità controllata.
• Le proteine interagiscono con i pori
delle microsfere e vengono trattenute
in base alla loro dimensione.
• Se una proteina, molto grande, non
interagisce con la matrice esce con un
volume di eluente pari al Void Volume
(volume vuoto).
Gel filtrazione
Gel filtrazione
VR  VM  K R VS
Gel filtrazione
• Vantaggi
– Semplice
– Prevedibile
• Svantaggi
– Bassa capacità (piccoli volumi)
– Soluzioni non viscose
Gel filtrazione
Determinazione peso molecolare
Una proteina
sconosciuta
eluisce a
170 mL:
40,000 Da (40KDa)
Cromatografia di scambio ionico
•
Scambio anionico
– A pH maggiore del pI (almeno una unità) la
proteina è carica negativamente e lega la
colonna a scambio anionico.
– L’eluizione avviene con [Cl-] crescente o
abbassando il pH (più difficile da controllare).
•
Scambio cationico
– A pH minore del pI (almeno una unità) la
proteina è carica positivamente e lega la
colonna a scambio cationico.
– L’eluizione avviene con [Na+] crescente o
alzando il pH.
Scambiatori ionici
Cromatografia di scambio ionico
Cromatografia di scambio ionico
• VANTAGGI
– Per grandi volumi,
– Grandi quantità di proteina (15 g proteina per 100 ml),
– Matrice molto robusta,
– Condizioni molto flessibili,
possibili molte variazioni.
• SVANTAGGI
– Proteine allo stesso pH e
concentrazioni di sali della
colonna.
– Ciò può essere scomodo poiché
poi occorre passare in dialisi
per togliere i sali.
Cromatografia per interazione idrofobica (HIC)
•
•
•
•
•
•
È un tipo di cromatografia sviluppato per la purificazione di
proteine, le separa sulla base della loro idrofobicità di
superficie.
I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le regioni
idrofobiche, sottraendo le molecole d’ acqua ordinate
le proteine tendono così ad interagire fra loro (“salting out”).
Nella HIC queste regioni così esposte tendono ad interagire
con una fase stazionaria costituita da gruppi idrofobici.
È una cromatografia che è vantaggioso applicare ad esempio
dopo il frazionamento con ammonio solfato.
L’eluizione può essere fatta con forza ionica decrescente oppure
per “spiazzamento” con detergenti non ionici (Tween 20, Triton
X-100).
Potenziali svantaggi:
– in alcuni casi le condizioni di eluizione possono provocare
denaturazione.
– non è predicibile, può applicarsi bene ad alcune proteine
ma non ad altre.
LIGANDO
Porzione
idrofobica
Molecole d'acqua
legate in modo ordinato
alla superficie idrofobica
Proteina
Molecole d'acqua
liberate in seguito alla
interazione idrofobica
alla superficie idrofobica
LIGANDO
Porzione
idrofobica
Proteina
O
O
CH3
OH
O
Butil Sefaroso
CH3
O
Octil Sefaroso
OH
Fenil Sefaroso
O
O
OH
Alchil Sefaroso
O
O
OH
CH3
CH3
CH3
Cromatografia di affinità
Resina
HO
O
HO
O
OH
Braccio spaziatore
O
OH
OH
OH
OH
Ligando
Cromatografia di
affinità
• Un ligando ad alta affinità per
la proteina è legato alla
matrice
• La proteina di interesse si lega
al ligando e viene
immobilizzata sulla colonna
• Le altre proteine vengono
“lavate” via.
• La proteina di interesse viene
eluita usando una soluzione di
ligando.
Metodi di eluizione nella cromatografia di affinità
Cromatografia di affinità
• VANTAGGI
• Alta affinità, costanti di
dissociazione nell’ordine del
mM, nM o anche pM.
• Legame tutto o nulla:
• Possibili molte variazioni
(affinity tags)
• SVANTAGGI
• L’ingombro sterico spesso
abbassa la capacità
• Il braccio spaziatore può avere
influenza sul legame
• L’eluizione può richiedere un
eluente specifico
Affinity tags
• Gli affinity tags sono si ottengono attraverso la preparazione di proteine
ricombinanti. Alla proteina di interesse è legato un tag che presenta
affinità con un ligando:
• TAG
–
–
–
–
–
GST
MBP
biotina
Poli-His
Proteina A
• LIGANDO
–
–
–
–
–
Glutatione
Maltosio
Avidina
Nichel, Zinco
Anticorpi
• Le proteine contenenti affinity tags sono poi isolati per cromatografia di
affinità con i ligandi legati alla colonna.
• Le proteine isolate possono poi venire primate degli affinity tag
attraverso proteolisi specifica.
Purificazione di anticorpi monoclonali
Cromatografia di affinità con anticorpi
Proteine di fusione (es. GST, glutatione-S-transferasi)
Immobilized metal ion Affinity Chromatography (IMAC)
Matrici attivate per immobilizzare
uno specifico ligando
Protocollo generale di purificazione proteine
Obiettivi:
• Cattura
– Isolare, concentrare e stabilizzare la proteina bersaglio
• Purificazione intermedia
– Eliminare la maggior parte dei contaminanti
• Polishing
– Ottenere la massima purezza possibile
AC: affinity chromatography
IEX: ion exchange
HIC: hydrophobic interaction chromatography
GF: gel filtration
RPC: reverse phase chromatography
Desalting
Esempio: purificazione in due passaggi di una cellulasi. Cattura e
purificazione intermedia mediante IEX
Esempio di cattura mediante HIC
1) Cattura IEX su resina Q
2) Purificazione con HIC
3) Polishing per GF
Metodi per ottenere informazioni sulla
sequenza aminoacidica delle proteine
Composizione amminoacidica
Derivatizzazione post-colonna
Derivatizzazione post-colonna
Determinazione dell’estremità N-terminale
Metodo di Sanger (FDNB) ed altri reattivi
Degradazione di Edman
Sequenziamento automatico
Degradazione di Edman
Proteolisi specifica
• Enzimi (endoproteinasi)
• Reattivi (es. bromuro di cianogeno)
Chemical cleavage
Cyanogen bromide
Carboxyl side of methionine residues
O-Iodosobenzoate
Carboxyl side of tryptophan residues
Hydroxylamine
Asparagine-glycine bonds
2-Nitro-5-thiocyanobenzoate
Amino side of cysteine residues
Enzymatic cleavage
Trypsin
Carboxyl side of lysine and arginine residues
Clostripain
Carboxyl side of arginine residues
Staphylococcal protease
Carboxyl side of aspartate and glutamate residues
(glutamate only under certain conditions)
Thrombin
Carboxyl side of arginine
Chymotrypsin
Carboxyl side of tyrosine, tryptophan, phenylalanine,
leucine, and methionine
Carboxypeptidase A
Amino side of C-terminal amino acid (not arginine,
lysine, or proline)
Alchilazione delle cisteine
 Se condotta in condizioni non riducenti permette di riconoscere residui Cys esposti
Struttura secondaria
Dicroismo circolare
Cromofori in ambienti asimmetrici assorbono in modo
diverso radiazioni polarizzate circolarmente in senso
opposto
Ellitticità in relazione alla legge di Lambert-Beer
A = Al - Ar = llc - rlc =  lc
[] = 3298 ∆
• Legame peptidico (180 - 250 nm)
• Residui aromatici (250 - 350 nm)
Reversible two-step unfolding of heme-human serum albumin:
a 1H-NMR relaxometric and circular dichroism study
(JBIC, 2009, 14, 209-217)
Regione del visibile
Banda di Soret
NEAR-UV
FAR-UV
Spettrometria di massa
Applicazioni in biologia
Spettrometria di massa
• Tecnica analitica separativa
• Ioni in fase gassosa separati in base alla loro
massa molecolare
• Analisi di frammenti che si generano per
attivazione e selezione di un singolo ione
Spettrometro di massa
Sorgente
Analizzatore
m/z
Grafico di intensità arbitraria in funzione
della massa della specie che ha generato quel picco
Rivelatore
Sorgenti:
per generare ioni in fase gassosa
• Ionizzazione diretta
– EI (impatto elettronico), CI (ionizzazione chimica)
• Desorbimento
– FAB
– MALDI
• Nebulizzazione
– ESI
Campione
gassoso
Ionizzazione diretta: EI
+
-
-
e-
.
+
M
2) M + e-
M-
1)
M+
+ 2e-
La molecola ionizzata per impatto elettronico ha un’energia interna
maggiore dell’energia interna del proprio stato fondamentale
Tendenza a frammentarsi:
si vedono i frammenti della molecola in esame
Campione
gassoso
Ionizzazione chimica: CI
CH4 + e-
CH4+ + 2eCH4+ + CH4
CH5+ + CH3.
+
M
.
Ha energia minore di M+
Quindi è più facile osservarlo
MH+
+
CH4
Si vede lo ione molecolare della molecola in esame
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
Laser-UV
Piastra (target)
hn
Campione
solido
1. Campione (A) miscelato
con matrice (M) e
asciugato sulla piastra.
AH+
2. Il Laser eccita la matrice.
3. Il campione è protonato e
ionizzato per
trasferimento energetico
Variable Ground
dalla matrice:
+20 kV
Grid
Matrice: derivati dell’acido cinnamico
Grid
MH+ + A  M + AH+.
Spettro MALDI/TOF di IgG
MH+
Relative Abundance
40000
30000
(M+2H)2+
20000
10000
(M+3H)3+
0
50000
100000
m/z
150000
200000
Electrospray Ionization (ESI)*
Campione
in soluzione
Vacuum Interface
charged
droplets form
High Voltage
–
+
+
Sampl
e Flow
+
+
++++
– +
++–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
To MS
+
+
Nebulizer Gas
Spray
Ions
released
* Broad range of implementations based on
flow rate and polarity of compound class
Ione a carica multipla
Spettro ESI del Tripsinogeno (MW 23983)
M + 15 H+
Relative Abundance
1599.8
M + 16 H+
M + 14 H+
1499.9
1714.1
M + 13 H+
1845.9
1411.9
1999.6
2181.6
m/z
Mass-to-charge ratio
La sorgente ESI può essere collegata all’uscita di
un sistema di separazione
0.18mm X 15cms C18 column
400nl/min
7:1 flow split
Mass spectrometer
LC
4µl/min
Fraction collector
Further MS analysis
Analizzatori di massa:
per separare ioni in base alla massa
• Time of Flight (TOF)
• Quadrupolo
• Trappola ionica
time-of-flight (TOF)
Ion Source
Flight Tube
20-25 kV
Detector
Principle: If ions are accelerated with the same potential at a fixed
point and a fixed initial time and are allowed to drift, the ions will
separate according to their mass to charge ratios.
time-of-flight (TOF)
Ion Source
Flight Tube
Detector
The ions enter the flight tube with the lighter ions
travelling faster than the heavier ions to the detector
time-of-flight (TOF)
Ion Source
Flight Tube
Detector
The lighter ions strike the detector before the heavier ions.
This “time of flight” (TOF) can be converted to mass
L’analizzatore TOF è accoppiato sempre al MALDI
perché permette di valutare masse grandi
Quadrupolo
Uses a combination of Radio
Frequency (RF) and Direct
Current (DC) voltages to
operate as a mass filter.
• Has four parallel metal
rods.
• Lets one mass pass through
at a time.
• Can scan through all
masses or sit at one fixed
mass.
Applicazione
Peptide Mass Fingerprinting (PMF)
L’approccio più comune di un software è di utilizzare un database proteico e per ogni
sequenza proteica calcolare tutti i peptidi che può produrre. Una volta che sono state
trovate queste corrispondenze, molti programmi calcolano la probabilità che il match
risultante sia o meno un falso-positivo.
1D or 2D gel
silver-stained
Run gel,
stain
MALDI-TOF
Excise spot,
destain, wash,
digest, extract
peptides
Spot onto plate and
mass analyze
Protein ID
Search all spectra against
protein databases
Peptide Mass Fingerprinting (MS)
intact
protein
peptide
fragments
enzyme
MEMEKEFEQIDKSGSWAAIYQDIRHEASDFPCRVAKLPKNKNRNRYRDVS
PFDHSRIKLHQEDNDYINASLIKMEEAQRSYILTQGPLPNTCGHFWEMVW
EQKSRGVVMLNRVMEKGSLKCAQYWPQKEEKEMIFEDTNLKLTLISEDIK
SYYTVRQLELENLTTQETREILHFHYTTWPDFGVPESPASFLNFLFKVRE
SGSLSPEHGPVVVHCSAGIGRSGTFCLADTCLLLMDKRKDPSSVDIKKVL
LEMRKFRMGLIQTADQLRFSYLAVIEGAKFIMGDSSVQDQWKELSHEDLE
PPPEHIPPPPRPPKRILEPHNGKCREFFPNHQWVKEETQEDKDCPIKEEK
GSPLNAAPYGIESMSQDTEVRSRVVGGSLRGAQAASPAKGEPSLPEKDED
HALSYWKPFLVNMCVATVLTAGAYLCYRFLFNSNT
MS & Proteomics
Tecniche di riframmentazioni successive
Tandem MS: ha due analizzatori
LC/MS/MS
MS/MS
Utile per sequenziare le proteine
• Si usa uno spettrometro con più di un analizzatore
• La proteina viene digerita e i frammenti peptidici sono introdotti nello strumento
• I peptidi vengono separati nel primo stadio di MS
• Alcuni peptidi vengono selezionati per una seconda analisi in MS. Questi
peptidi possono essere selezionati in base alla massa, all’intensità del picco o altro
• Il singolo peptide viene frammentato mediante collisioni con atomi di gas inerte
• I frammenti sono analizzati
MS/MS -Tandem MS
Informazioni strutturali (es. Sequenza)
Sample
ionized
Mass
selected
Fragmentation
Analyze
fragments
Applying two or more steps of mass analysis separated in space or time (in the same
instrument) to select an analyte (ion) of interest from a mixture and generate
fragments from it to give structural information.
Frammentazione di peptidi
xn-i
= Most common
yn-i
vn-i
yn-i-1
wn-i
zn-i
-HN-CH-CO-NH-CH-CO-NHRi
CH-R’
i+1
ai
R”
i+1
bi
low energy fragments
ci
di+1
bi+1
high energy fragments
MS/MS
Quantitative Proteomics
• Labelling (ICAT, iTRAQ, SILAC, 18O
enrichment, …)
• Label free (AQUA, SRM/MRM, …)
Quantitative Proteomics
•Labelling (ICAT, iTRAQ, SILAC, 18O enrichment, …)
•Label free (AQUA, SRM/MRM, …)
Isotope-coded affinity tagging (ICAT)
Isobaric Tagging for Relative and Absolute
Quantitation (iTRAQ)
SILAC
(Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture)
•Stable isotopes are added in culture media.
•Isotopes are included in new-synthetized proteins.
Natural isotopes
in essential
aminoacids
(light medium)
Stable isotopes in
essential
aminoacids
(heavy medium)
•Relative quantification in MS1, on the basis of the intensities of the same
peptide
•PRO: early labelling : no technical variability accurate quantification
•CONS: only in proliferating models
SILAC in Silac-mouse
Selected/Multiple reaction monitoring
(SRM/MRM)
Absolute Quantification
= to determine the
concentration of a protein
in a sample as ng/mL or
number of copies/cell
1) Quantification is possible thanks to isotope-labelled standards
(petides/proteins)
-Standard Peptides (Absolute QUAntification -AQUA-) or proteins (absolute SILAC, Protein
Standard for absolute Quantification - PSAQ-) are added to the sample at a known concentration
-A lot of preliminary work to choose and synthetize peptides with a known mass (incorporated
isotopes)
2) Quantification is obtained elaborating MS data and appliying algorithms
-Es. APEX algorithm based on machine-learning: thanks to experimental data is possible to
estimate the probability to detect a peptide
XL-MS
XL-MS
XL-MS