UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI PADOVA
Dipartimento di
di Scienze Oncologiche e Chirurgiche
- Sezione di Oncologia Facoltà di Medicina e Chirurgia
DOTTORATO DI RICERCA IN ONCOLOGIA E ONCOLOGIA CHIRURGICA
- XXI CICLOCICLO-
STRATEGIE DI TERAPIA
TERAPIA ANTIANTI-ANGIOGENICA CON
IFNIFN-α IN UN MODELLO DI NEOPLASIA
PROSTATIC
PROSTATICA
STATICA SPONTANEA
Coordinatore : Ch.mo Prof.ssa Paola Zanovello
Supervisore : Ch.mo Prof. Alberto Amadori
Dottorando
Dottorand : Persano Luca
Ai miei genitori
INDICE
RIASSUNTO................................
RIASSUNTO................................................................
................................................................................................
............................................................................
............................................ - 1 ABSTRACT ................................................................
................................................................................................
.............................................................................
............................................. - 3 INTRODUZIONE................................
INTRODUZIONE................................................................
................................................................................................
....................................................................
.................................... - 5 Il carcinoma prostatico ................................................................................... - 5 Il modello TRAMP (Transgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate)- 14 Angiogenesi tumorale ................................................................................... - 19 Angiogenesi e carcinoma prostatico ............................................................ - 23 Interferoni di tipo I per il trattamento dei tumori...................................... - 27 SCOPO DELLA
DELLA TESI ................................................................
.............................................................................................
............................................................. - 32 MATERIALI E METODI ................................................................
.......................................................................................
....................................................... - 33 Produzione dei vettori lentivirali................................................................. - 33 Esperimenti in vivo e preparazione dei tessuti............................................ - 34 Estrazione di acidi nucleici dai tessuti ......................................................... - 35 Studi di biodistribuzione mediante real-time PCR ..................................... - 37 Reazione di retrotrascrizione ....................................................................... - 38 Real-time PCR............................................................................................... - 38 Immunoistochimica e immunofluorescenza ............................................... - 42 Analisi statistica ............................................................................................ - 45 RISULTATI ................................................................
................................................................................................
...........................................................................
........................................... - 46 Studio dell’angiogenesi durante la progressione tumorale nel modello
TRAMP.......................................................................................................... - 46 -
Valutazione del trasferimento genico in vivo e degli effetti biologici mediati
da IFN-α.........................................................................................................- 50 L’espressione di IFN-α inibisce l’angiogenesi e la proliferazione cellulare nei
tumori prostatici. ...........................................................................................- 56 Espressione di proteine indotte da IFN-α in campioni di carcinoma prostatico
umano.............................................................................................................- 61 DISCUSSIONE................................
DISCUSSIONE................................................................
................................................................................................
.......................................................................
....................................... - 64 -
RIASSUNTO
IASSUNTO
L’interferone alfa (IFN-α) è il prototipo delle citochine con effetto antiangiogenico, di cui sono noti gli effetti terapeutici in numerosi modelli tumorali.
Questa azione è stata attribuita principalmente ad effetti indiretti, come l’inibizione
della produzione di fattori pro-angiogenici da parte delle cellule tumorali ed anche a
effetti diretti di IFN-α sulla proliferazione e motilità delle cellule endoteliali. Lo
scopo di questo lavoro è stato di investigare quali fossero gli effetti del trattamento
con IFN-α sul processo angiogenico che viene indotto dalle cellule cancerose
durante le prime fasi della progressione tumorale. A tal fine abbiamo utilizzato il
modello del topo TRAMP (Transgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate) in
cui la cancerogenesi è guidata dall’espressione androgeno-regolata degli antigeni T/t
di SV40. Per ottenere una produzione sostenuta di IFN-α, i topi TRAMP sono stati
inoculati per via intraperitoneale con vettori lentivirali producenti IFN-α, e
successivamente è seguita la valutazione degli effetti trascrizionali e biologici.
La somministrazione di IFN-α ha provocato una regolazione in senso positivo di
trascritti coinvolti nell’inibizione dell’angiogenesi e della proliferazione cellulare
-1-
quali GBP-1, IFI16 e CXCL10-11; poiché i livelli di questi trascritti sono stati
riscontrati elevati già dalle prime fasi dopo il trattamento, potrebbero essere
mediatori degli effetti biologici dell’IFN-α. A questi effetti trascrizionali si
accompagnano gli effetti sulla vascolatura tumorale, quali la riduzione della densità
vascolare intraduttale e l’aumento della maturità dei vasi, associati ad una marcata
inibizione della proliferazione delle cellule tumorali, senza peraltro influenzare i
livelli di apoptosi. Alla luce di questi risultati abbiamo voluto investigare se anche
nel carcinoma prostatico umano ci potessero essere evidenze di espressione di IFN-α
endogeno. La valutazione immunoistochimica di una serie di tumori prostatici
umani ha evidenziato come una parte di questi (15/31) esprimano la proteina GBP-1
e che esiste una correlazione con un’altra proteina indotta da IFN-α quale MxA,
indicando come in un sottogruppo di pazienti con carcinoma prostatico vi sia una
produzione endogena di IFN-α.
In sintesi, questi risultati indicano che l’IFN-α è in grado di inibire il processo
angiogenico e la proliferazione cellulare durante le prime fasi della tumorigenesi
prostatica. L’espressione di GBP-1 e MxA in campioni clinici potrebbe identificare
un sottogruppo di pazienti con peculiari caratteristiche biologiche.
-2-
ABSTRACT
Interferon-alpha (IFN-α) is the prototype of anti-angiogenic cytokines with
recognized therapeutic activity in transplantable and orthotopic tumors, and also in
prostatic cancer models. This activity has been mainly attributed to indirect effects,
such as the down-regulation of pro-angiogenic factors, or direct effects on
proliferation and motility of endothelial cells. Aim of this study was to investigate
the effects of IFN-α on the angiogenic switch occurring during the early phases of
tumor development in the Transgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate
(TRAMP) model in which tumorigenesis is driven by an androgen-regulated early
gene (T/t antigen) of SV40. To provide sustained IFN-α production, TRAMP mice
were injected i.p. with IFN-α-producing lentiviral vectors, followed by analysis of
the IFN-mediated transcriptional and biologic effects.
In the prostate of TRAMP mice, IFN-α administration resulted in sustained upregulation of IFN-α-regulated genes endowed with anti-angiogenic and antiproliferative functions, including guanylate binding protein 1 (GBP-1), IFI16 protein
and CXCL10-11; since the levels of these transcripts increased at early time points
following treatment, they could be primary mediators of the biologic effects of IFN-
-3-
α. These transcriptional changes were accompanied by effects on the tumor
vasculature, including reduction of intraductal microvessel density and increased
pericyte coverage, and marked reduction of tumor cell proliferation, whereas tumor
cell apoptosis was unchanged. Intriguingly, a subgroup of human prostatic tumors
analyzed (15 out of 31) disclosed GBP-1 protein expression, and this correlated with
the expression of another IFN-regulated protein, MxA, thus hinting at endogenous
IFN-α in a subset of prostate cancer patients.
Overall, our findings demonstrate that IFN-α is able to counteract the angiogenic
switch and impair tumor cell proliferation during the early phases of prostatic
cancer progression. The detection of GBP-1 and MxA expression in clinical samples
of prostatic cancer may identify a tumor subset with distinct biological features.
-4-
INTRODUZIONE
INTRODUZIONE
Il carcinoma prostatico
Nei Paesi Occidentali l’adenocarcinoma della prostata rappresenta una delle
neoplasie più diffuse seconda solo alle neoplasie polmonari e del colon-retto, tanto
che risulta essere il tumore con più alta incidenza negli uomini al di sopra dei 65
anni. La probabilità di sviluppare carcinoma prostatico aumenta molto in funzione
dell’età, quindi più l’aspettativa media di vita aumenta e la mortalità dovuta ad altre
patologie diminuisce, più il carcinoma prostatico acquista importanza dal punto di
vista epidemiologico (van Moorselaar and Voest, 2002). Non si sono ancora definiti
dei chiari fattori di rischio per lo sviluppo di questa patologia anche se fattori
genetici, lo stile di vita, e fattori ambientali come la dieta sono sicuramente coinvolti
nella patogenesi, in aggiunta all’età che, ad oggi, è ancora considerata il fattore di
rischio più determinante. Dal punto di vista ambientale, la vitamina D, alcuni
carotenoidi contenuti nel pomodoro e il selenio possono svolgere un ruolo protettivo
nei confronti del carcinoma prostatico, mentre una dieta ricca di grassi e carni rosse
sembra essere un fattore promuovente. Poiché la maggior parte dei fattori protettivi
sono dei potenti antiossidanti, è largamente riconosciuto che lo stress ossidativo
-5-
possa contribuire alla carcinogenesi (Gurel et al., 2008). Inoltre, livelli circolanti di
insulin-like growth factor 1 (IGF1), che possono essere influenzati dalla dieta, sono
stati implicati nello sviluppo del carcinoma prostatico (Pollak, 2001).
I fattori ereditari sono responsabili di circa il 10% dei tumori prostatici e sono
spesso associati allo sviluppo precoce della neoplasia (Carter et al., 1993). Negli
ultimi dieci anni moltissimi studi epidemiologici hanno portato evidenze sempre più
solide dell’esistenza di potenziali loci genetici di suscettibilità al carcinoma
prostatico (Ostrander et al., 2006), che sono stati poi identificati in diverse posizioni
del genoma (Nwosu et al., 2001). Infatti, per i familiari di primo grado di pazienti
affetti da carcinoma prostatico il rischio di sviluppare tale patologia aumenta di 2-3
volte. Il rischio più elevato è stato riscontrato in familiari che presentano più di un
parente affetto da carcinoma prostatico o familiari a cui è stata diagnosticata la
patologia in giovane età (Stanford and Ostrander, 2001; Verhage and Kiemeney,
2003).
La prostata è una ghiandola tubulo alveolare composta da molteplici acini
secretori, ciascuno formato da cellule epiteliali che circondano un lume centrale. Il
lume è riempito dalle secrezioni prodotte dalle cellule epiteliali che lo delineano. Il
secreto prostatico viene drenato mediante un sistema di ramificazioni composte da
dotti epiteliali fino a raggiungere l’uretra prostatica (Isaacs, 1994). Il compartimento
epiteliale è composto da due tipi cellulari, le cellule basali e quelle epiteliali
ghiandolari (Figura 1). La funzione delle cellule basali non è stata ancora
completamente compresa, ma sembra che una piccola parte del comparto basale sia
composto da cellule staminali progenitrici delle cellule epiteliali ghiandolari
(Robinson et al., 1998).
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Figura 1
Figura 1.
1 Schema rappresentativo della progressione tumorale nella prostata. La figura mostra le
diverse fasi della cancerogenesi a partire dai tessuti prostatici normali passando per le lesioni preneoplastiche (PIN), localmente invasive (adenocarcinoma), fino al carcinoma metastatico e la
concomitante perdita strutturale della lamina e delle cellule basali. Modificata da Abate-Shen, et al.
2000.
La neoplasia origina dai gruppi ghiandolari periferici della prostata (Figura 2), e
nel 95% dei casi è classificabile come adenocarcinoma, mentre l’iperplasia prostatica
benigna (IPB), una alterazione morfologica non maligna che si verifica
frequentemente in uomini anziani, origina dalla zona di transizione. Inizialmente il
tumore può essere del tutto asintomatico o manifestarsi con sintomi di prostatismo
sovrapponibili a quelli di altre affezioni della prostata di natura benigna, e
successivamente con segni di tipo ostruttivo. Al momento della diagnosi, il
carcinoma della prostata risulta essere nel 63% dei casi localizzato, nel 22% invasivo,
mentre nel 15% dei pazienti è già metastatico. Nelle fasi iniziali, ovvero quando è
ancora confinato all’interno della capsula, il carcinoma prostatico è curabile
essenzialmente mediante trattamento chirurgico, terapia radiante o recentemente
anche mediante brachiterapia, che permette un limitato coinvolgimento dei tessuti
sani circostanti mediante un posizionamento più focalizzato della sorgente radiante.
Infatti in una buona parte dei casi il tumore è poco aggressivo, tanto che la maggior
-7-
parte degli uomini a cui è stato diagnosticato un cancro alla prostata muore poi per
altre cause. Tuttavia, se diagnosticato tardivamente o nelle forme più aggressive, il
carcinoma prostatico può progredire verso stadi caratterizzati da invasione locale
delle vescicole seminali e metastatizzazione ossea che risulta generalmente essere
letale. La progressione verso la malattia metastatica è generalmente succeduta
dall’androgeno-indipendenza del tumore, che spesso segue a sua volta la terapia di
ablazione ormonale (Abate-Shen and Shen, 2000; Harding and Theodorescu, 1998).
Figura 2
Figura 2.
2 Localizzazione anatomica della ghiandola prostatica umana. Rappresentazione anatomica
delle 3 zone in cui viene usualmente suddivisa la ghiandola prostatica e che sono distinte dal punto di
vista istologico e funzionale.
La natura eterogenea e multifocale del carcinoma prostatico pone delle
significative difficoltà diagnostiche. L’indagine istologica condotta su tessuti di
carcinoma prostatico rivela infatti la presenza simultanea sia di ghiandole normali,
che di foci preneoplastici (PIN) e foci neoplastici di svariato grado. Per tenere conto
di questa complessità Gleason propose un sistema per la stadiazione del grado
istologico che ad oggi è il sistema maggiormente usato dai patologi poiché risulta
-8-
essere un valido strumento prognostico (Egevad et al., 2002): le caratteristiche
istologiche predominanti vengono riassunte da un valore numerico da 1 a 5 in cui 1
indica una neoplasia poco aggressiva mentre 5 molto aggressiva, e in modo simile
viene associato un punteggio da 1 a 5 alle caratteristiche di invasività tumorale
(Figura 3). La somma derivante dai punteggi di queste due caratteristiche varia,
quindi, da un valore minimo di 2 ad un massimo di 10. I valori più bassi (2-4)
indicano una malattia poco aggressiva e con progressione più lenta. Un punteggio
compreso tra 5 e 7 esprime un aspetto intermedio mentre una somma tra 8 e 10
indica che le cellule tumorali hanno caratteristiche di elevata aggressività (Gleason,
1966; Gleason, 1992). Nonostante la buona correlazione che sussiste tra il Gleason
score e la sopravvivenza dei pazienti, non sono ancora noti i fattori implicati nella
velocità di progressione di pazienti che presentano rispettivamente punteggi bassi
(4-5) o alti (8-10) di Gleason score. Inoltre, la presenza di micrometastasi o di cellule
tumorali circolanti spesso non correla con la stadiazione, rendendo più difficile la
valutazione prognostica. Per tali ragioni, fino ad ora, non ci sono ancora stati metodi
di screening in grado di predire in modo preciso la prognosi di pazienti con tumore
della prostata localizzato (Paradis et al., 1998).
-9-
Figura 3
Figura 3.
3 Cartoon rappresentante i disegni originali di Gleason per la definizione del Gleason Score, il
sistema di stadiazione più comunemente usato nella neoplasia prostatica.
Per quanto riguarda la multifocalità, ci sono evidenze che lesioni neoplastiche
distinte lo siano anche dal punto di vista genetico e che quindi abbiano una natura
non clonale: queste osservazioni suggeriscono che diversi foci neoplastici possano
evolvere indipendentemente, rendendo più complesso lo studio dei meccanismi di
insorgenza della patologia. Da un punto di vista pratico, l’eterogeneità e la
multifocalità delle lesioni prostatiche, combinate con le dimensioni ridotte
dell’organo, rendono molto difficoltoso il recupero di quantità adeguate di tessuti
omogenei per le analisi molecolari. Questi fattori hanno posto finora delle
limitazioni considerevoli sia all’identificazione dei geni implicati nella carcinogenesi
prostatica, che alla definizione degli eventi molecolari coinvolti nell’iniziazione e
progressione del carcinoma prostatico. Solo negli ultimi anni l’avanzamento
- 10 -
tecnologico operato grazie alla microdissezione laser di singoli foci neoplastici ha
permesso lo studio di popolazioni relativamente pure di cellule tumorali prostatiche
(Macintosh et al., 1998).
Le alterazioni geniche correlate al tumore della prostata descritte in letteratura
sono numerose; risultano coinvolti oncosoppressori e oncogeni ma, nella maggior
parte dei casi, non sono ancora noti i geni effettivamente coinvolti nell’iniziazione e
progressione così come non è nota l'esatta successione temporale di tali alterazioni
ed il loro ruolo durante la crescita tumorale. Le alterazioni geniche che vengono
spesso associate allo sviluppo di carcinoma prostatico coinvolgono oncogeni,
oncosoppressori e i cosiddetti “soppressori delle metastasi”(Karayi and Markham,
2004).
C-MYC: gene coinvolto nella differenziazione cellulare e spesso up-regolato in
cellule proliferanti. Diversi studi hanno mostrato che i livelli trascrizionali di CMYC sono elevati in campioni di carcinoma prostatico rispetto a tessuti normali o
con IPB (Buttyan et al., 1987), tuttavia altri studi che utilizzavano la tecnica
dell’ibridizzazione in situ non hanno confermato questi risultati (Funa et al., 1991).
Inoltre il gene non sembra essere soggetto ad amplificazione in questi tumori.
C-ERB-B2: codifica per una proteina simile all’EGFR. Il meccanismo di
attivazione di C-ERB-B2 in molti tumori umani è l’amplificazione, che tuttavia non
è stata frequentemente riscontrata nel carcinoma prostatico. I livelli trascrizionali di
questo gene sono bassi in tumori prostatici localizzati, mentre più del 60% di
pazienti con tumori ormone-indipendenti ne presentano una over-espressione
indicandone un possibile associazione con la terapia anti-androgena (Shi et al.,
2001).
EZH2: codifica per una proteina di cui è nota l’attività di repressione
trascrizionale mediante l’induzione della deacetilasi istonica 2. L’RNA messaggero di
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questo gene è stato trovato up-regolato in modo significativo in campioni di
carcinoma prostatico rispetto a tessuti benigni ed è indice di una cattiva prognosi.
EZH2 nei tumori prostatici inibisce la trascrizione e, di contro, attiva la
proliferazione (Varambally et al., 2002).
RB: il prodotto di questo gene inibisce la divisione cellulare prevenendo il
passaggio delle cellule dalla fase G1 a S. Diversi studi, eseguiti anche su campioni
primari di carcinoma prostatico, hanno riportato mutazioni troncanti, delezioni o
perdita allelica in circa un terzo dei campioni analizzati (Phillips et al., 1994).
P53: fosfoproteina nucleare che media il blocco delle cellule al check point G1-S.
Classicamente nei tumori la sua funzione viene inattivata da mutazioni puntiformi.
Alterazioni del gene P53 sono state riscontrate soprattutto nelle fasi più avanzate di
tumore prostatico (Al-Maghrabi et al., 2001).
PTEN: codifica per una fosfatasi con omologia sia per la famiglia delle tirosinfosfatasi, che per delle proteine del citoscheletro. L’overespressione di PTEN
promuove l’arresto delle cellule in fase G1 del ciclo. PTEN è stato riportato essere
deleto o mutato in una frazione significativa di molti tumori epiteliali. Nella prostata
sono state riportate LOH e mutazioni somatiche soprattutto in campioni di
carcinoma prostatico metastatico (30%) rispetto a tumori localizzati (5%). Questo
aumento delle alterazioni di PTEN nelle fasi avanzate della patologia sembra
indicarlo come possibile marker di progressione metastatica (Cairns et al., 1997;
Rubin et al., 2000).
E-Caderina: le caderine sono proteine di superficie che svolgono un ruolo
fondamentale nel riconoscimento e adesione cellulare, e inibizione da contatto.
Alterazioni dei complessi E-Caderina/Catenina, sono implicate in diversi steps della
progressione neoplastica. L’espressione di E-Caderina è spesso ridotta nelle fasi più
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avanzate di progressione del carcinoma prostatico e sono state riportate frequenti
delezioni nello stesso locus genico (Carter et al., 1990).
RNASEL: il gene codifica per una ribonucleasi che media le attività antivirali e
pro-apoptotiche degli interferoni. La presenza di un particolare allele definito come
“high risk” predispone allo sviluppo di carcinoma prostatico (Smith et al., 1996).
GSTP1: coinvolto nella detossificazione di composti elettrolitici mediante
coniugazione con il Glutatione. L’ipermetilazione di questo gene è l’alterazione
epigenetica più comune (>90%) nei tumori prostatici. L’ipermetilazione sembra
essere un evento precoce e dunque un promettente marker per la determinazione di
un carcinoma prostatico ancora localizzato (Harden et al., 2003).
KAI-1: il prodotto è localizzato sulla membrana e per questo si pensa abbia un
ruolo nelle interazioni cellula-cellula o cellula-matrice. L’espressione di KAI-1 è
elevata nella prostata normale o in campioni di IPB, ma è ridotta nelle cellule
derivate da tumore. La proteina è stata trovata down-regolata in campioni di
carcinoma prostatico metastatico rispetto alla prostata normale e questa espressione
anormale comunemente non è indotta da mutazioni o LOH (Dong et al., 1996).
CD44: anch’esso codifica per una proteina di membrana implicata nella
soppressione delle metastasi. Sussiste un rapporto di correlazione inversa tra il
Gleason score e l’espressione di CD44 (Nagabhushan et al., 1996).
NM23: ci sono evidenze sempre maggiori del coinvolgimento di questa proteina
nel controllo della proliferazione e del differenziamento cellulare. L’overespressione del gene NM23 è stata riscontrata frequentemente nell’adenocarcinoma
prostatico e potrebbe essere un evento precoce della tumorigenesi prostatica (Jensen
et al., 1996).
Gli obiettivi futuri saranno quelli di caratterizzare i meccanismi molecolari
coinvolti nell’iniziazione e progressione del carcinoma prostatico in modo tale da
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poter acquisire una visione più meccanicistica della tumorigenesi prostatica
utilizzando idonei modelli animali (Abate-Shen and Shen, 2000).
Il modello TRAMP (Transgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate)
I modelli murini di carcinogenesi spontanea hanno svolto un ruolo essenziale
nello studio di diversi tipi di tumore come per esempio il carcinoma mammario
(Callahan, 1996; Clarke, 1996), pancreatico (Longnecker et al., 1992; Standop et al.,
2001), del colon-retto (Fodde et al., 1999), dell’ovaio (Stakleff and Von Gruenigen,
2003), del polmone (Arteaga, 2006) e anche del carcinoma della prostata (AbateShen and Shen, 2002; Ahmad et al., 2008). I modelli classici di carcinogenesi
ormonale quali i ratti Lobund-Wistar, che possiedono una predisposizione genetica
ereditaria alla carcinogenesi prostatica indotta dagli androgeni (Bostwick et al.,
2000), hanno dimostrato che la prostata murina può essere usata come modello
sperimentale del carcinoma prostatico umano, a differenza delle colture in vitro o di
tumori generati mediante xenotrapianto di linee stabilizzate. Un modello murino di
tumorigenesi spontanea può infatti mimare in modo più realistico il complesso
pattern di interazioni che sussistono tra i vari tipi cellulari, i diversi tessuti e i
compartimenti ormonali che sono parte di organi complessi come quelli sopra
elencati. Data la complessità innata delle patologie in questione, è importante
definire i parametri di un modello murino ideale per lo studio dei tumori (Huss et
al., 2001b; Shappell et al., 2004). Nel nostro caso, un modello murino ideale
dovrebbe:
sviluppare carcinoma prostatico in modo riproducibile e con una penetranza del
100%;
rappresentare in modo riproducibile le diverse fasi della progressione tumorale
tipica della patologia in questione;
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sviluppare metastasi in siti bersaglio simili a quelli del carcinoma prostatico
umano;
dimostrare la sensibilità agli androgeni nelle fasi iniziali di crescita tumorale e
successivamente evolvere verso una forma di carcinoma ormone indipendente;
possedere un sistema immunitario intatto e funzionante;
presentare gli stessi meccanismi biologici e molecolari dello sviluppo della
malattia e della sua progressione presenti nell’uomo;
avere delle ragionevoli finestre temporali per poter intervenire in modo
preventivo o terapeutico durante la sperimentazione;
avere dei sistemi semplici per l’allevamento, la riproduzione, lo screening.
Questione fondamentale per generare modelli murini appropriati e validi è
dunque aver ben presente quali siano i punti in comune e le differenze tra la biologia
della prostata umana e di quella murina. Mentre infatti nell’uomo vi è la possibilità
di sviluppare iperplasia prostatica benigna (IPB) o neoplasia prostatica intraepiteliale
(PIN), questo non avviene naturalmente nei roditori che non sviluppano in modo
spontaneo né IPB né cancro alla prostata (De Marzo et al., 1999).
Da un punto di vista anatomico la prostata umana adulta circonda la parte
superiore dell’uretra e si possono distinguere tre regioni: una zona periferica, una di
transizione e una zona centrale (Figura 2); la prostata dei roditori invece consiste di
quattro lobi separati: anteriore, dorsale, laterale e ventrale, anch’essi che circondano
l’uretra (Figura 4). Nonostante queste differenze, studi morfologici supportano il
fatto che ci sia una similitudine funzionale tra il lobo laterale murino e la zona
periferica della ghiandola umana (Huss et al., 2001b) rendendo il modello del topo
TRAMP uno strumento fondamentale per lo studio del carcinoma prostatico.
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Figura 4
Figura 4.
4 Localizzazione anatomica della prostata murina e indicazione dei diversi lobi di cui è
composta. Modificata da Abate-Shen, et al. 2000.
Il TRAMP è un modello murino generato dal ceppo C57Bl/6 mediante
l’inserimento della sequenza –426/+28 della regione regolatoria della rat probasin
(rPB), per l’espressione specifica a livello della prostata degli early genes di SV40: T
(Tag) e t. Il transgene è regolato dagli androgeni, quindi la sua espressione correla
con la maturità sessuale. A seguito dell’espressione dei geni di SV40, gli animali
sviluppano un carcinoma prostatico invasivo in grado di metastatizzare a livello dei
linfonodi pelvici e dei polmoni (Greenberg et al., 1995). Il carcinoma prostatico nel
modello TRAMP sviluppa spontaneamente delle mutazioni a livello del recettore per
gli androgeni e quindi mima in modo molto stretto la patologia nell’uomo poiché,
anche in questo caso, la patologia procede verso una fase di tumore ormoneindipendente. Durante la progressione tumorale si possono distinguere diverse fasi
di crescita tumorale (Kaplan-Lefko et al., 2003):
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Neoplasia prostatica intraepiteliale (PIN): le lesioni PIN sono caratterizzate dalla
crescita a ciuffi dell’epitelio, dalla presenza di nuclei ipercromatici e allungati, e da
un aumento dei processi di mitosi e apoptosi (Figura 5; A,B,C).
Adenocarcinoma ben differenziato (WD): caratterizzato da una aumentata
quantità di piccole ghiandole, in associazione ad una risposta desmoplastica e ad un
assottigliamento dello stroma. I nuclei sono più tondi e meno ipercromatici rispetto
al PIN. Mitosi e apoptosi sono di limitata entità e sono associate ad una modesta
risposta infiammatoria (Figura 5; D,E,F).
Adenocarcinoma
moderatamente
differenziato
(MD):
caratterizzato
dalla
formazione di foglietti anaplastici che possono contenere ancora una sorta di
reminescenza ghiandolare. Non è una fase osservata di frequente (Figura 5; G,H,I).
Adenocarcinoma scarsamente differenziato (PD): caratterizzato da una spinta
irregolarità dei nuclei con un piccolissimo spessore di citoplasma attorno. Ci sono
spesso ghiandole normali intrappolate all’interno di foglietti di cellule tumorali. In
questa fase il tumore è ampiamente vascolarizzato, emorragico e le lesioni più ampie
possono essere diffusamente necrotiche (Figura 5; J,K,L).
Lesioni simil-filloide (PHY): queste lesioni presentano uno stroma ipercellulare.
Fino ad ora il TRAMP è l’unico modello in cui sono riscontrabili delle lesioni di
questo tipo. (Figura 5; M,N,O).
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Figura 5
Figura 5 . Rappresentazione istologica delle diverse fasi della progressione del carcinoma prostatico
nel modello TRAMP. A,B,C: neoplasia prostatica intraepiteliale (rispettivamente 10X, 20X, 40X);
D,E,F: adenocarcinoma ben differenziato (10X, 20X, 40X); G,H,I: adenocarcinoma moderatamente
differenziato (10X, 20X, 40X); J,K,L: adenocarcinoma scarsamente differenziato (10X, 20X, 40X);
M,N,O: lesioni simil-filloide (10X, 20X, 40X) (Kaplan-Lefko et al., 2003). In generale, le forme di
carcinoma moderatamente differenziato e lesioni phylloides-like non sono molto frequenti e sono
state riscontrate fino ad ora solo nei topi più vecchi.
- 18 -
Se nei topi TRAMP definiamo come carcinoma prostatico la presenza di una
qualsiasi forma di adenocarcinoma (WD, MD, PD) in almeno uno dei lobi della
prostata, possiamo allora affermare che l’incidenza del carcinoma è pari al 100% dei
topi di 12 settimane, anche se le zone tumorali sono strettamente confinate a
piccolissime zone di ogni lobo. In generale nella prostata dorsale, laterale e
posteriore, si osserva una progressione da tessuto normale al PIN già a 8 settimane di
vita, fino ad avere il completo spettro istologico della progressione neoplastica a 24
settimane di età. Progressivamente le cellule tumorali prostatiche tendono a perdere
la loro differenziazione epiteliale, ad assumere una morfologia mesenchimale e ad
aumentare il proprio potenziale metastatico (Epithelial to Mesenchymal Transition;
EMT). In questo modello l’EMT è stata associata alla perdita della molecola di
adesione E-caderina, presente nei casi di PIN e WD e del tutto assente o quasi nelle
fasi successive di crescita neoplastica (Kaplan-Lefko et al., 2003); anche i tumori
prostatici umani ben differenziati solitamente presentano l’espressione di questa
molecola di cui viene persa o ridotta l’espressione nei tumori meno differenziati o
indifferenziati (Tomita et al., 2000).
Angiogenesi
Angiogenesi tumorale
Un prerequisito per la crescita tumorale, invasione tissutale e disseminazione
metastatica è l’angiogenesi, un processo multistep che prevede la formazione di
nuovi vasi sanguigni dalla vascolatura pre-esistente e che include l’attivazione,
proliferazione e migrazione delle cellule endoteliali (EC), degradazione delle
membrane basali vascolari, rimodellamento della matrice extracellulare dei tessuti,
formazione di nuove reti vascolari, reclutamento di cellule accessorie come cellule
muscolari liscie e periciti, e la connessione alla rete vascolare pre-esistente (Kong
and Crystal, 1998; Persano et al., 2007).
- 19 -
L’angiogenesi fisiologica avviene nella maggior parte dei casi nell’embrione e
negli adulti si verifica solo durante l’ovulazione, la gravidanza e processi quali la
riparazione delle ferite e la ricrescita endometriale, o secondaria a processi patologici
quali infiammazione e ipossia mediata da infarto o tumori (Folkman, 1995).
L’angiogenesi è coinvolta anche in altre patologie quali artrite reumatoide, psoriasi,
aterosclerosi, restenosi e retinopatie diabetiche (Webb and Vande Woude, 2000).
Nel 1971 Judah Folkman fu il primo a suggerire che la crescita tumorale potesse
essere dipendente dalla formazione di una nuova rete di vasi sanguigni (Folkman,
1971). Ad oggi è largamente riconosciuto che l’angiogenesi è un processo
indispensabile per i tumori. Infatti più del 95% dei carcinomi hanno origine come
micro-tumori in situ che si formano in strati epiteliali chiaramente distinti dalla
vascolatura pre-esistente: questi noduli microscopici di cellule cancerose sono in
grado di crescere e formare dei tumori macroscopici solo dopo l’attivazione del
processo angiogenico nei tessuti adiacenti al nodulo (Figura 6). L’attivazione del
processo angiogenico risulta quindi un evento cruciale poiché il reclutamento
cellulare di ossigeno e altri nutrienti può avvenire in modo diffusivo in piccoli
tumori che non contengono vasi, ma non può avvenire se il tumore è di dimensioni
maggiori di 100-200μm.
L’angiogenesi è un fenomeno regolato da moltissimi fattori pro-angiogenici quali
il basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), Vascular Endothelial Growth Factor
(VEGF), Angiopoietina-1, Interleuchina 4, Interleuchina 8; o anti-angiogenici come
Angiostatina,
Endostatina,
Platelet
Factor
4
(PF4),
Interferone-α
e
-β,
Trombospondina e altri. L’attivazione dipende dallo sbilanciamento di un equilibrio
finemente regolato che sussiste nei tessuti normali tra fattori pro- e anti-angiogenici,
che possono essere secreti sia dalle cellule tumorali che da altri componenti dello
stroma quali leucociti, cellule endoteliali e fibroblasti (Folkman, 1992; Folkman and
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Klagsbrun, 1987; Folkman and Shing, 1992; Fukumura et al., 1998; Gimbrone et al.,
1973; Hanahan and Folkman, 1996). L’attivazione del così definito “angiogenic
switch” determina lo sbilanciamento della produzione dei fattori a favore di quelli
pro-angiogenici e di conseguenza la crescita tumorale (Yancopoulos et al., 2000).
Figura 6
Figura 6.
6 Rappresentazione delle diverse fasi dell’attivazione dell’angiogenesi da parte delle cellule
tumorali. La secrezione di fattori pro-angiogenici da parte delle cellule tumorali stimola la migrazione
delle cellule endoteliali e la creazione di nuovi capillari.
Sono stati descritti almeno 3 meccanismi con cui le cellule tumorali sono in grado
di attivare lo switch angiogenico e creare una nuova rete vascolare:
I tumori possono cooptare la vascolatura esistente. Le cellule tumorali possono
crescere attorno ai vasi pre-esistenti, indurre l’apoptosi delle cellule endoteliali che li
compongono, distruggere l’architettura tridimensionale vascolare e successivamente
indurre la formazione di nuovi rami vascolari (Holash et al., 1999). Un esempio in tal
senso è fornito dai gliomi che durante le prime fasi sono in grado di adattare la
propria crescita alla rete vascolare pre-esistente e di indurre l’angiogenesi solo
durante le fasi più avanzate della neoplasia (Bergers and Benjamin, 2003).
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Reclutamento di precursori ematopoietici. Il tumore può mobilizzare, mediante la
secrezione del VEGF ed altri fattori chemotattici, precursori ematopoietici ed
endoteliali (Grunewald et al., 2006) e reclutarli dalla circolazione sanguigna in modo
tale che vadano ad integrarsi nel letto vascolare dei vasi di nuova formazione. Anche
se questi eventi di integrazione hanno spesso una bassa frequenza (5% di
incorporazione), molti studi preclinici ne indicano un ruolo chiave nella
vasculogenesi (Asahara et al., 1997; Bertolini et al., 2006; Lyden et al., 2001).
Reclutamento leucocitario. Alcuni tipi di tumore possono mobilizzare cellule
ematopoietiche differenziate come mast-cellule, monociti, macrofagi (Coussens et
al., 1999), monociti esprimenti il recettore Tie2 (De Palma et al., 2005), cellule
dendritiche (Conejo-Garcia et al., 2004) e altre cellule del sistema immunitario che
possono supportare l’angiogenesi tumorale mediante il rilascio di molecole proangiogeniche o di proteasi che conferiscano una maggiore capacità invasiva alle
cellule endoteliali (Bergers et al., 2000; Swann et al., 2007).
In aggiunta a quanto detto, un ruolo fondamentale è svolto dal fattore di
trascrizione indotto dall’ipossia (hypoxia-inducible factor-1α o HIF-1α) che
promuove l’aumento di molti fattori angiogenici tra cui VEGF e PDGF (Carmeliet et
al., 1998). Infatti l’ipossia è una caratteristica intrinseca dei tumori che è stata
riportata sin dalle prime osservazioni (Thomlinson and Gray, 1955). Bassi livelli di
ossigeno promuovono la stabilizzazione proteica di HIF-1α che a sua volta controlla
il trasporto di ossigeno ai tessuti mediante il controllo dell’angiogenesi e favorisce
l’adattamento metabolico all’ipossia attraverso la via glicolitica. Oltre all’upregolazione di VEGF, la stabilizzazione di HIF-1α controlla l’espressione di più di 40
geni implicati nel trasporto e nel metabolismo del glucosio e nella sopravvivenza
delle cellule tumorali (Semenza et al., 1994; Wang et al., 1995).
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Angiogenesi e carcinoma prostatico
Fino ad ora moltissimi studi hanno riportato come in svariate tipologie di tumore
solido, tra cui il carcinoma prostatico, gli stadi più avanzati della progressione
neoplastica sono associati ad un’elevata attivazione dell’angiogenesi e un progressivo
aumento della densità vascolare (mean vessel density; MVD) rispetto agli stessi
tessuti che presentano lesioni benigne o a tessuti normali (Bigler et al., 1993;
Weidner et al., 1993). Questa osservazione è valida anche per alcune lesioni preneoplastiche (Brown et al., 1993; Weidner et al., 1991). Ad esempio, diversi studi sul
carcinoma prostatico hanno dimostrato come aree di PIN presentano un aumento
della densità vascolare negli acini e nei dotti rispetto all’epitelio benigno (Brawer et
al., 1994). Oltre all’aumento della vascolarizzazione, durante la progressione del
carcinoma prostatico si assiste, lungo tutte le diverse fasi di crescita tumorale
(Gleason’s score, TNM, grado istopatologico), anche ad un graduale aumento di
espressione dei fattori coinvolti nell’attivazione dell’angiogenesi come per esempio il
VEGF, i suoi recettori e il bFGF (Pallares et al., 2006). L’attivazione dell’angiogenesi
nel carcinoma prostatico risulta essere complessa e coinvolgere molti fattori tra cui i
più rilevanti sono elencati qui di seguito (Nicholson and Theodorescu, 2004):
VEGF: è stato il primo fattore di questo tipo ad essere stato isolato e ad oggi è
ancora la molecola più frequentemente presente nelle aree con attiva proliferazione
endoteliale (Senger et al., 1983). L’espressione di VEGF e del suo recettore è regolata
da numerosi fattori quali l’ipossia, fattori di crescita e citochine; è regolata inoltre
dalle interazioni cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare. Nel carcinoma
prostatico, l’espressione del VEGF è stata correlata alla transizione da tessuti normali
a PIN e aumenta nelle fasi successive di progressione (Borgstrom et al., 1998; Ferrer
et al., 1998; Kollermann and Helpap, 2001). L’espressione di VEGF correla anche con
l’MVD (Ferrer et al., 1997).
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bFGF: potente attivatore del processo angiogenico, agisce inducendo le cellule
endoteliali ad invadere la matrice circostante e a formare strutture tubulari simili a
capillari. VEGF e bFGF sono in grado di attivare l’angiogenesi in modo sinergico e
con grande rapidità (Pepper et al., 1992). Il ruolo del bFGF nell’attivazione
angiogenica del cancro alla prostata è stato controverso (Connolly and Rose, 1998),
ma ci sono evidenze che ne sottolineano l’importanza durante la progressione da
tessuto normale a PIN (Ropiquet et al., 2000).
Interleuchina 8: mediatore angiogenico di derivazione macrofagica. Funziona
come fattore chemotattico e mitogeno per le cellule endoteliali; ne è stata dimostrata
la maggiore espressione in adenocarcinoma prostatico rispetto a tessuti prostatici
normali o con iperplasia prostatica benigna (Ferrer et al., 1997; Ferrer et al., 1998).
TGF-β: la funzione usuale di questa proteina è quella di inibire la proliferazione
di cellule epiteliali di varia origine, ma sembra essere in grado anche di stimolare la
proliferazione di cellule dello stroma come i fibroblasti. Inoltre TGF-β può stimolare
la progressione tumorale mediante promozione dell’angiogenesi e inibizione della
risposta immunitaria. E’ dimostrato che le cellule tumorali sono in grado di evitare il
potente effetto inibitorio di questo fattore attraverso la down-regolazione del suo
recettore. In molti casi di carcinoma prostatico sono stati riscontrati livelli molto
bassi del recettore per TGF-β (Williams et al., 1996) e solitamente la sua overproduzione in parallelo alla perdita di espressione dei suoi recettori sono associati ad
una prognosi peggiore (Wikstrom et al., 1998).
Ciclossigenasi-2 (COX-2): enzima che catalizza la produzione di prostaglandine a
partire dall’acido arachidonico, indotto dall’ipossia, la sua espressione sembra
collegata a quella del VEGF. I livelli di espressione di COX-2 rilevati in iperplasia
prostatica benigna sono minori rispetto a quelli rilevati in tessuti neoplastici; le
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cellule tumorali infatti sono in grado di produrre grandi quantità di COX-2 rispetto
ai tessuti normali o ai tumori benigni (Madaan et al., 2000).
HIF-1α: principale fattore rilasciato dalle cellule tumorali in condizioni di ipossia,
nel carcinoma prostatico sembra accrescere la rapidità della crescita tumorale e la
potenzialità metastatica del tumore (Zhong et al., 1998).
Attivatori del plasminogeno (Pas) e Metalloproteasi della Matrice (MMPs):
proteasi implicate nella degradazione della matrice extracellulare e della membrana
basale vascolare. Uno dei più importanti attivatori del plasminogeno è l’Urokinase
type plasminogen activator (uPA), che assieme al suo recettore uPAR (Urokinase
type plasminogen activator receptor), è stato ritrovato espresso in linee
particolarmente aggressive di carcinoma prostatico (Hoosein et al., 1991).
Oltre a questi fattori, sembrano svolgere un ruolo importante anche i Tumorassociated macrophages (TAMs), una popolazione di cellule infiammatorie che
svolgono un ruolo importante nell’angiogenesi. I TAMs sono infatti in grado di
influenzare ogni fase del processo angiogenico mediante il rilascio di citochine proo anti-tumorali a seconda del microambiente in cui si trovano (Lissbrant et al.,
2000). La ridotta infiltrazione dei TAMs è stata associata ad una maggiore
progressione del carcinoma prostatico verso un fenotipo più aggressivo mediata dalla
conseguente riduzione della produzione di NOS2 e TNF-α, che possono contribuire
in modo diretto o indiretto alla citotossicità tumorale (Shimura et al., 2000).
La valutazione della densità microvascolare può essere applicata anche al modello
di carcinogenesi prostatica del topo TRAMP, nel quale sono stati descritti 2 eventi
angiogenici successivi che supportano la progressione tumorale (Figura 7).
Innanzitutto si osserva un evento di iniziazione che corrisponde all’espressione del
fattore HIF1-α, il VEGF e il suo recettore VEGFR1, a cui si associa il reclutamento di
una vascolatura intraduttale e cioè presente all’interno degli acini ghiandolari,
- 25 -
normalmente sprovvisti di vasi. Conseguentemente a tale switch angiogenico
primario, si verifica un ulteriore switch durante la progressione, che prevede un
aumento costante dell’espressione del VEGF, l’ipo-espressione del VEGFR1 e l’upregolazione del VEGFR2. Durante tutta la progressione si assiste inoltre ad un
graduale aumento dell’IMVD definita come densità vascolare intraduttale (Huss et
al., 2001a). L’osservazione dell’espressione di VEGFR2 nella vascolatura e il
concomitante spegnimento dell’espressione di VEGFR1 è consistente con la funzione
intrinseca a cui sono stati associati questi 2 recettori: nonostante il VEGFR1 sia
importante per la migrazione delle cellule endoteliali, non sembra essere in grado di
attivare la cascata di signalling intracellulare che media la proliferazione
(Waltenberger et al., 1994); il VEGFR2, invece, è in grado di attivare dei segnali
anti-apoptotici all’interno delle cellule e quindi sembra essere maggiormente
implicato nella proliferazione delle cellule endoteliali (Gerber et al., 1998). Una
rappresentazione schematica delle diverse fasi di attivazione angiogenica nel
modello TRAMP è riportata in Figura 7.
Per quanto riguarda i componenti della famiglia dell’FGF, un recente studio ha
delucidato l’importanza di questi fattori durante la progressione neoplastica nel topo
TRAMP e la cinetica di espressione delle diverse isoforme dell’FGF e dei suoi
recettori, indicando i membri di questa famiglia di fattori come possibili regolatori
del processo di iniziazione e progressione angiogenica in questo modello. Per di più,
molti pattern di espressione descritti per l’asse dell’FGF sono sovrapponibili a
osservazioni fatte in campioni di carcinoma prostatico umano (Huss et al., 2003).
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Figura
Figura 7
Figura 7.
7 Attivazione a due steps dell’angiogenesi nel modello TRAMP. Lo switch angiogenico è
caratterizzato dall’espressione primaria di HIF1-α e di VEGF in concomitanza alla presenza del
VEGFR1. Durante le fasi successive viene gradualmente persa l’espressione del VEGFR1 e acquisita
quella del VEGFR2, parallelamente all’aumento della densità vascolare. Modificata da Huss et al.
2001.
Il pattern di progressione tumorale nel modello TRAMP, che è così ben definito
sia dal punto di vista temporale che molecolare, mette quindi a disposizione una
finestra temporale ben delineata per l’uso di molecole con attività anti-angiogenica
durante i primi steps della progressione neoplastica come dimostrato in recenti studi
(Becker et al., 2002; Huss et al., 2003; Isayeva et al., 2007).
Interferoni di tipo I per il trattamento dei tumori
Gli interferoni sono una famiglia di glicoproteine scoperte negli anni ’50 per via
delle loro proprietà anti-virali (Isaacs et al., 1957). Questa famiglia di citochine
stimola in modo autocrino e paracrino i networks cellulari che regolano la resistenza
alle infezioni virali, potenziano la risposta immunitaria adattativa ed innata e
modulano la sopravvivenza e morte di cellule normali e tumorali.
- 27 -
In seguito al legame con il proprio recettore gli interferoni attivano una cascata di
segnali intracellulari mediati da JAK/STAT da cui dipendono i loro effetti biologici.
Gli interferoni possono essere suddivisi in 3 sottofamiglie principali (di tipo I, II, III)
in funzione dei recettori a cui si legano. Gli interferoni di tipo I (IFN-α,β,ω,κ,ε,δ,τ) si
legano ai recettori IFNAR1 e IFNAR2 che formano un eterodimero al contatto con il
ligando. Poiché l’affinità dei diversi interferoni è generalmente maggiore per
IFNAR2, si pensa che l’interazione più probabile preveda prima il legame con
IFNAR2 e il successivo coinvolgimento di IFNAR1. L’IFN-γ è una singola proteina
designata come interferone di tipo II per la sua scarsa omologia con gli interferoni di
tipo I. Quando si lega ai propri recettori IFNGR1 e IFNGR2, l’IFN-γ forma un
complesso costituito da 2 molecole di ogni recettore che legano un omodimero di
IFN-γ. Gli interferoni di tipo III sono costituiti da 3 sottotipi di IFN-λ, che sono
prodotti assieme all’IFN-β, attivano la stessa cascata di segnalazione intracellulare,
ma si legano a un eterodimero composto da IFNLR1 e IL10R2 (Figura 8). Tutti questi
diversi recettori sono accoppiati in vario modo a delle proteine tirosinchinasiche
intracellulari (JAK 1-2 e TYK 1-2) in grado di attivare i segnali intracellulari
mediante l’attivazione delle proteine STAT 1-2 (Borden et al., 2007).
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Figura 8
Figura 8.
8 Gli interferoni di tipo I interagiscono con i recettori IFNAR1 e IFNAR2; quelli di tipo II con
IFNGR1 e IFNGR2; e gli interferoni di tipo III con IFNLR1 e il recettore per l’interleuchina 10
IL10R2 (Borden et al., 2007).
La famiglia più numerosa è composta dagli interferoni di tipo I ai quali è stata
associata un’azione antitumorale pleiotropica. La complessità degli effetti risulta
chiara se si pensa che IFN-α è in grado di modulare l’espressione di più di 300 geni.
Gli Interferoni α e β hanno innanzitutto un’azione antiproliferativa diretta sulle
cellule tumorali che comprende l’inibizione del ciclo cellulare mediata dall’arresto
delle cellule in fase G1 del ciclo (Tanabe et al., 2000). Tuttavia hanno anche le
seguenti proprietà:
Immunomodulazione; sono in grado di aumentare l’attività litica di cellule
citotossiche quali le cellule NK e aumentare l’immunogenicità delle cellule tumorali
mediante la stimolazione delle cellule dendritiche e APC (Glimcher et al., 2004;
Kirkwood et al., 2002; Swann et al., 2007).
- 29 -
Induzione dell’apoptosi; è stata identificata in svariate cellule maligne
l’attivazione da parte degli interferoni dei fattori pro-apoptotici APO2L/TRAIL e
Fas; inoltre gli interferoni permettono di sensibilizzare le cellule tumorali alla
risposta T e NK mediante la regolazione delle molecole MHC I (Chawla-Sarkar et al.,
2003; Chen et al., 2001; Sato et al., 2001).
Inibizione dell’angiogenesi; gli interferoni sono state le prime citochine antiangiogeniche identificate. Sono in grado di inibire direttamente la motilità e la
proliferazione delle cellule endoteliali (Albini et al., 2000). Inoltre sono in grado di
inibire l’espressione del bFGF (Slaton et al., 1999), VEGF (von Marschall et al.,
2003), IL8 (Oliveira et al., 1992), e MMP-9 (Slaton et al., 1999; von Marschall et al.,
2003) da parte delle cellule tumorali e di modulare in senso positivo altre
chemochine coinvolte nell’inibizione dell’angiogenesi quali CXCL9, CXCL10 e
CXCL11 (Feldman et al., 2006; Reznikov et al., 1998; Yang and Richmond, 2004).
Nelle cellule endoteliali uno dei geni indotti da IFN, GBP-1, è stato molto studiato
per la sua attività di inibizione della proliferazione delle cellule endoteliali e
dell’angiogenesi (Guenzi et al., 2001; Guenzi et al., 2003).
Dal punto di vista clinico, il primo interferone ad essere stato approvato per il
trattamento di una neoplasia è stato l’IFN-α2, impiegato per il trattamento della
leucemia cronica B a cellule capellute e successivamente anche per la leucemia
mieloide cronica (CML). In entrambi i casi il trattamento era in grado di diminuire
l’infiltrazione di cellule maligne nel midollo e di stabilizzare i parametri ematologici
periferici. Inoltre nella CML il trattamento era in grado di ridurre il numero di
cellule trasformate con traslocazione BCL-ABL. Ad oggi comunque il trattamento
con IFN-α2 è stato soppiantato dall’Imatinib per la sua maggiore efficacia terapeutica
(Borden et al., 2007). Inoltre l’attività terapeutica dell’IFN-α2 è stata dimostrata in
più di una dozzina di neoplasie tra cui mieloma, linfomi, melanoma, carcinoma
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renale e della vescica e sarcoma di Kaposi. E’ riportato ad esempio che in linfomi di
vario istotipo l’IFN-α2 si è dimostrato in grado di indurre regressione tumorale in
quasi metà dei pazienti coinvolti nello studio (Rohatiner et al., 2005).
Sebbene il trattamento con IFN-α si sia dimostrato efficace nella terapia di diverse
neoplasie, le poche informazioni sui meccanismi molecolari in grado di produrre gli
effetti antitumorali ne hanno sicuramente frenato lo sviluppo, oltre al fatto che come
altri potenti mediatori fisiologici gli interferoni hanno diversi effetti collaterali,
soprattutto se somministrati ad alte dosi. Gli effetti avversi principali includono
astenia, febbre, perdita di peso, aumento delle transaminasi, granulocitopenia e
depressione. Nonostante questo, l’induzione di geni a valle con azione angiostatica
assieme alla down-regolazione di fattori angiogenici e agli effetti diretti
antiproliferativi sulle cellule tumorali, rendono gli interferoni farmaci interessanti
anche per sviluppi futuri, probabilmente con dei protocolli di somministrazione che
ne riducano le dosi e conseguentemente gli effetti collaterali. Per quanto riguarda
l’uso di IFN-α per il trattamento del carcinoma prostatico, questo approccio ha
dimostrato gli stessi limiti di efficacia riscontrati in altre neoplasie, ma finora il suo
utilizzo è stato limitato a pazienti con carcinoma prostatico in fase avanzata o
androgeno-indipendente (Shinohara et al., 1998; Thalasila et al., 2003). Rimane
quindi da indagare l’utilizzo di queste citochine durante le prime fasi della
progressione tumorale, una fase preventiva dove sembra che i trattamenti antiangiogenici possano avere maggiore efficacia (Bisacchi et al., 2003; Indraccolo et al.,
2005).
- 31 -
SCOPO DELLA TESI
Alla luce del sempre maggior numero di pubblicazioni che sottolineano le
potenzialità dell’uso degli interferoni come molecole anti-angiogeniche in ambito
oncologico, e preso atto dei limiti del loro utilizzo in pazienti con tumori in fase
avanzata, si è stabilita la necessità di studiare gli effetti di queste citochine durante le
prime fasi di progressione neoplastica. L’obiettivo di questa tesi è stato, in primo
luogo, quello di valutare gli effetti del trattamento con IFN-α durante le prime fasi
di progressione neoplastica nel modello di carcinogenesi prostatica spontanea
TRAMP. Inoltre ci siamo occupati di verificare la presenza di proteine regolate da
IFN-α in campioni di carcinoma prostatico umano. L’identificazione di un
sottogruppo di pazienti con espressione di IFN-α endogeno a livello prostatico
potrebbe infatti definire una popolazione con caratteristiche clinico-patologiche
peculiari.
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MATERIALI E METODI
Produzione dei vettori lentivirali
I vettori prodotti sono vettori lentivirali basati sul virus dell’immunodeficienza
umana (HIV), di tipo auto-inattivante. Per la produzione di tali vettori è stata usata
una tecnica di trasfezione transiente a 3 plasmidi mediante precipitazione con calcio
fosfato secondo uno schema utilizzato già precedentemente nel nostro laboratorio
(Indraccolo et al., 2002). Al giorno zero sono state seminate 4x106 cellule 293T per
fiasca di coltura da 75 cm2 ed il giorno seguente è stato aggiunta una soluzione 2M
CaCl2 contenente:
12µg del costrutto pRRL-SIN18-cPPT-inserto-PRE contenente il gene di interesse
(EGFP, muIFN-α oppure nessun inserto) sotto il controllo trascrizionale del
promotore del citomegalovirus (CMV);
6µg del plasmide pCMV∆R8.74 che esprime i geni gag e pol del virus HIV-1 sotto
il controllo della LTR (long terminal repeats) virale. Il costrutto manca della
sequenza packaging ψ e quindi non viene incapsidato all’interno dei nuovi virioni
prodotti;
- 33 -
2µg del plasmide codificante per la proteina G del virus della stomatite vescicolare
(VSV-G). VSV-G permette di ampliare lo spettro d'ospite del virus, infatti i suoi
recettori sono fosfolipidi di membrana ubiquitari, presenti in gran parte delle cellule
eucariotiche.
La soluzione è stata aggiunta, goccia a goccia, a 0,5 ml di tampone HBS 2X (274
mM NaCl, 10mM KCl, 1,5 mM Na2HPO4∗7H2O, 12mM Destrosio, 42 mM HEPES,
pH 7,1) e dopo 20 minuti aggiunta alle cellule che sono quindi state riposte in
incubatore a 37°C. Dopo 12 ore il terreno di coltura è stato sostituito con del nuovo
terreno e il terzo giorno è stato quindi raccolto il sovranatante virale, filtrato con
filtri di 0,45µm di diametro e conservato a –80°C. Per gli esperimenti in vivo, i
vettori lentivirali sono stati concentrati mediante ultracentrifugazione in una
centrifuga Beckman con un rotore SW41 a 50.000g (25.000 rpm) a 4°C per 2 ore.
Per la titolazione dei vettori codificanti EGFP ed IFN-α è stato effettuato il
dosaggio mediante saggio ELISA del quantitativo di p24gag equivalenti (Innogenetics,
Gent, Belgio) nello stock del vettore. Si stima che 1ng di p24gag equivalenti
corrisponda a 100.000 TU (Transfecting Units).
Esperimenti in vivo e preparazione dei tessuti
Per la caratterizzazione del processo angiogenico, infiammatorio e dei trascritti
correlati all’IFN-α topi TRAMP di svariate età (almeno 6 per ogni punto temporale
di analisi) sono stati sacrificati in base alle esigenze sperimentali; gli animali non
transgenici dello stesso ceppo (C57Bl/6) di età corrispondente sono stati usati come
controllo.
In tutti gli esperimenti topi TRAMP di 6 settimane di età sono stati inoculati per
via intraperitoneale con 1μg di p24gag equivalenti dei vettori LV-EGFP, LV-IFN
oppure un LV- e sacrificati secondo il seguente schema sperimentale:
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Al raggiungimento dell’età di interesse gli animali sono stati sacrificati e sono stati
prelevati la prostata e vari organi che, immediatamente congelati in azoto liquido,
venivano conservati in congelatore a -80°C. In alcuni casi porzioni di lobi prostatici
sono state fissate in formaldeide 4% tamponata, processati e inclusi in paraffina.
Gli animali sono stati
allevati nel nostro stabulario in condizioni “specific
pathogen free”. Le procedure concernenti gli animali ed il loro trattamento adottate
in questo studio sono conformi alle leggi e alle linee guida nazionali ed
internazionali in materia (EEC Councile directive 86/609, OJ L 358, 12 Dicembre
1987).
Estrazione di acidi nucleici dai tessuti
Per la procedura di estrazione del DNA genomico dai tessuti per gli studi di
biodistribuzione, è stato utilizzato il kit Easy DNATM (Invitrogen, Groningen,
Olanda) secondo le procedure indicate dai produttori. Brevemente, i frammenti di
- 35 -
tessuto sono stati omogenati per circa 30sec/1min in PBS con l’utilizzo del sistema
Ultra-Turrax® T18 Basic (IKA, Staufen, Germania) e quindi è stata aggiunta la
soluzione di lisi (350µl di buffer A) alla quale segue un periodo di incubazione di 10
minuti a 65°C. Successivamente si aggiungono 150 µl di Buffer B (che blocca la
reazione di lisi), i campioni vengono mescolati vigorosamente e quindi sono stati
aggiunti 500 µl di cloroformio. Dopo una centrifugata a 13000 rpm per 15 minuti a
+4°C nella provetta si distinguono così tre fasi: una fase contenente il cloroformio,
una fase solida contenente le membrane cellulari e i residui proteici ed una fase
acquosa superiore che contiene il DNA. A questo punto il DNA contenuto nella
soluzione è stato fatto precipitare mediante una serie di centrifugate in etanolo e
risospeso in 50µl di acqua. A seguito è stato eseguito il trattamento con 1µl di RNasi
(2 mg/ml) per 30 minuti a 37°C per eliminare le eventuali contaminanti di RNA e i
campioni stoccati a -20°C per le successive analisi.
Per l’estrazione dell'RNA dai tessuti murini presi in esame ai fini di analizzare il
livello di espressione dei geni d'interesse, è stato utilizzato l’RNeasy mini kit,
(Qiagen, Hilden, Germania). I frammenti di tessuto sono stati omogenati per circa
30sec/1min in 700µl di buffer di lisi RLT contenente β-mercaptoetanolo con
l’utilizzo del sistema Ultra-Turrax® T18 Basic (IKA, Staufen, Germania) e
successivamente ulteriormente disgregati mediante ripetuti passaggi attraverso l'ago
di una siringa (diametro < 0.8 mm). Nel caso dell’estrazione dell’RNA dai leucociti
presenti nel sangue la lisi meccanica è stata effettuata esclusivamente attraverso il
passaggio in siringa. Gli acidi nucleici sono stati quindi resi insolubili mediante
l’aggiunta di pari volume di etanolo al 70% e trasferiti su colonnina di purificazione
(RNeasy mini column) che li trattiene. I campioni hanno subito quindi diversi cicli
di lavaggio, il trattamento con DNasi al fine di eliminare l'eventuale contaminante di
DNA ed eluizione finale mediante il lavaggio della colonna con 30-35µl di H2O
- 36 -
RNasi-free. La quantificazione e la verifica della qualità dell'RNA estratto è stata
effettuata mediante la corsa elettroforetica degli acidi nucleici, visualizzazione al
transilluminatore (Gel Doc 1000, Bio Rad, Hercules, CA) e analisi mediante il
software Multi-Analyst 1.1 (Bio Rad, Hercules, CA).
Studi di biodistribuzione mediante realreal-time PCR
L’efficienza di trasduzione delle cellule in vivo è stata calcolata mediante un
protocollo precedentemente usato nel nostro laboratorio (Indraccolo et al., 2002) che
permette di stimare il numero di copie di vettore virale per microgrammo di DNA
genomico. Il DNA genomico è stato estratto da diversi tessuti murini e dalla prostata
dei topi TRAMP precedentemente inoculati con LV-EGFP mediante Easy DNATM
Kit (Invitrogen, Groningen, Olanda). Il numero di copie del gene EGFP è stato
stimato in duplicato mediante real-time PCR che consente quindi la valutazione
quantitativa del gene in esame. Ogni campione è stato amplificato per il gene
reporter EGFP e per il gene endogeno della subunità ribosomiale 18S che nel nostro
caso ha la funzione di housekeeping gene (Klein et al., 2000). Ogni PCR è stata
eseguita in un mix composto da:
1µl DNA (alla concentrazione di 50-100ng/µl);
12.5µl di Taq Man Universal PCR master Mix (PE Applied Biosystems, Foster
City, CA);
primer forward (300nM) e primer reverse (300nM) (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO);
sonda fluorescente (100nM) (PE Applied Biosystems, Foster City, CA);
H2O sterile fino ad un volume di 25µl.
Per quantificare l’EGFP è stata preparata una curva standard usando il DNA
estratto da una linea cellulare contenente una singola copia del gene in esame; i
- 37 -
valori calcolati per ogni campione sono stati quindi plottati sulla curva standard ed è
stato calcolato il numero di copie di EGFP. Per esprimere i risultati in percentuale di
cellule trasdotte, è stato usato il fattore di conversione di 6.6pg di DNA per cellula
diploide. Come controllo negativo sono stati usati dei topi che avevano ricevuto il
vettore LV- oppure topi non trattati. I primers usati per l’amplificazione del gene
EGFP e la sonda fluorescente corrispondente sono riportati in Tabella 1.
Reazione di retrotrascrizione
Per la retrotrascrizione è stato utilizzata la SuperScript II, una trascrittasi MoMLV ingegnerizzata in cui l'attività endonucleasica è assente (Invitrogen, Paisley,
UK). Si prepara per ogni campione un primo mix contenente 0,5-1µg di RNA del
campione, 150ng di random esameri e 10mmoli di deossinucleotidi trifosfato
(dNTPs). I campioni subiscono uno step di 5 minuti a 65°C e quindi l’aggiunta di un
altro mix contenente:
4µl di First-Strand buffer 5x;
2µl di ditiotreitolo 0,1M (DTT);
1µl di SuperScript II reverse transcriptase (200 unità/µl).
E’ stato usato il seguente programma di retrotrascrizione : 25°C 10'; 42°C 50'; 70°C
15'; 4°C. Il cDNA così ottenuto è stato usato direttamente per la PCR o conservato a 80°C per successivi utilizzi.
Realeal-time PCR
La Real-Time PCR è una tecnologia che permette la quantificazione dei prodotti
di amplificazione. La rilevazione dei prodotti di PCR direttamente nella provetta è
resa possibile misurando la fluorescenza di una molecola "reporter" la quale aumenta
- 38 -
con l’accumularsi del prodotto di reazione. Nel nostro caso abbiamo usato il
cromoforo SybrGreen, un intercalante fluorescente (emette a 520nm) la cui intensità
di fluorescenza è 100 volte maggiore quando è legato al doppio filamento di DNA.
Per ovviare ad eventuali differenze tra campioni nella quantità di RNA utilizzato
e nell’efficienza di retrotrascrizione, il valore di espressione del gene bersaglio viene
normalizzato rispetto al valore di un gene "housekeeping" (nel nostro caso β-actina,
GAPDH, G6PDH e RPII) ritenuto espresso allo stesso livello in tutti i campioni; la
lista completa dei primers usati è riportata in Tabella 1. L’analisi ci fornisce, per ogni
campione, un valore di "Ciclo soglia" (Ct) che viene determinato nella fase
esponenziale della reazione di amplificazione ed è il ciclo in cui si ha un segnale di
fluorescenza 10 volte superiore al rumore di fondo. Ciò è stato fatto con il metodo
comparativo dei Ct (metodo ∆∆Ct) basato sulla formula:
∆∆Ct = (Cttarget/trattato -Cthousek./trattato)-(Cttarget/non trattato-Cthousek./non trattato)
Il rapporto numerico tra l’espressione del gene bersaglio nella condizione di
interesse e l’espressione dello stesso nella condizione di riferimento è ricavabile dalla
formula:
Espressione relativa=2-∆∆Ct
Sebbene la metodica permetta una quantificazione assoluta, ai fini dello studio è
stata sufficiente una quantificazione relativa, mettendo a confronto l’espressione dei
geni d’interesse nei topi trattati con LV-IFN rispetto a quelli dei topi trattati con il
vettore di controllo. In tutte le reazioni il valore di efficienza è stato mantenuto
nell’intervallo 95-105%, limiti entro cui si è sicuri di poter valutare in maniera
adeguata differenze sia in positivo che in negativo.
- 39 -
Ogni singola reazione di PCR è stata eseguita in duplicato in un volume di 20µl
usando piastre ottiche da 96 pozzetti (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Il
mix di reazione era composto da:
1µl cDNA;
10µl di Platinum SybrGreen qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen, Paisley, UK);
primer forward (10µM) e primer reverse (10µM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO;
Tabella 1);
H2O sterile fino ad un volume di 20µl.
E’ stato usato il seguente programma di PCR: 50°C 2' (attivazione dell'enzima
UDG); 95°C 10' (attivazione della polimerasi); [95°C 15''; 60°C 1'] per 40 cicli. Per la
rilevazione del segnale fluorescente SybrGreen è stato utilizzato l'ABI Prism 7900
Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA).
- 40 -
Tabella 1.
1 Primers usati per le reazioni di PCR
Sequenza (5’(5’-3’)
β-Act
Irf-7
Ifit1
Ifi27
Mx1
Mx2
Cxcl10
Cxcl11
Gbp-1
Ifi204
for
atgctctccctcacgccatc
rev
cacgcacgatttccctctca
for
gaccttggatctactgtgg
rev
tagaaagcagagggcttg
for
gccttgctgaagtgtggag
rev
tggcgataggctacgactgc
for
aagcctggtagccacactcc
rev
tcagagcaaggctccaacag
for
gctgtcattggggaccagagt
rev
atttcagcaccagagggcatc
for
ggacattgccaccacagagg
rev
tacaccaggttccgcaccac
for
tgctgggtctgagtgggact
rev
ggataggctcgcagggatga
for
cccagatccaagcaagctc
rev
tcttattggagggctcacagtc
for
ccgcacaggcaaatcctacc
rev
ttcttggggtgaggcacaca
for
gtgccagtcaccaatactccac
rev
tctgggaatgttctgattctgg
- 41 -
Amplificato
(paia di basi)
126
145
122
103
112
144
131
136
123
100
Tabella 1.
1 Primers usati per le reazioni di PCR
Sequenza (5’(5’-3’)
Trail
Vegf
bFgf
Angpt1
Cyclin D2
p16
Egfp
Egfp234v
for
ggctgtgtctgtggctgtga
rev
ccatcagtggagtcccagaa
for
acccacgacagaaggagagc
rev
cggggtactcctggaagatg
for
caagcagaagagagagga
rev
ttccagtcgttcaaagaagaa
for
ggaagggaaccgagcctact
rev
ctgaaatcggcaccgtgtaag
for
gctgctggagtgggaactg
rev
gcttgcgaaggatgtgctc
for
caggtgatgatgatgggcaac
rev
ggagaaggtagtggggtcct
for
gcagtgcttcagccgctac
rev
aagaagatggtgcgctcctg
probe
vic-ccgaccacatgaagcagcacgactt-tamra
Amplificato
(paia di basi)
130
116
132
138
95
90
96
-
Immunoistochimica e immunofluorescenza
Per la colorazione in immunoistochimica sezioni di 4μm di prostata congelate
oppure fissate in formalina e incluse in paraffina sono state reidratate e processate
mediante procedure standard. I vasi sono stati evidenziati mediante un anticorpo
monoclonale di ratto anti-CD31 (Becton-Dickinson, San Josè, CA) mentre
l’espressione di GBP-1 ed MxA è stata valutata mediante l’utilizzo rispettivamente di
- 42 -
un anticorpo monoclonale di ratto che riconosce la variante umana del GBP-1 (1B1;
(Lubeseder-Martellato et al., 2002)) e un anticorpo monoclonale murino anti-MxA
(Flohr et al., 1999). L’immunocolorazione è stata effettuata usando la tecnica del
complesso avidina-biotina-perossidasi (Vector Laboratories, Burlingame, CA) e la 33’diamminobenzidina (DAB; Dako, Glostrup, Danimarca) come cromogeno. Le
sezioni sono state poi controcolorate con Ematossilina di Mayer. Durante ogni
colorazione sono stati usati gli appropriati controlli negativi sostituendo l’anticorpo
primario con del tampone fosfato (PBS). La densità media di vasi intraduttali è stata
calcolata mediante la conta dei vasi presenti nelle zone della sezione a più alta
concentrazione vascolare: per ogni campione sono stati analizzati almeno 10 campi
microscopici ad un ingrandimento di 400x.
Per l’analisi in immunofluorescenza sono state reidratate sezioni congelate di
tumore prostatico dello spessore di 4μm e incubate per 1h con una soluzione
saturante composta da: 5% di siero preimmune di capra, 1% albumina sierica bovina
(BSA) e 0.1% Triton-X 100 in PBS. Successivamente i campioni sono stati marcati
con gli appropriati anticorpi primari secondo le condizioni di utilizzo specifiche per
ogni anticorpo (Tabella 2). Per la rilevazione degli l'anticorpi primari sono stati
utilizzati i seguenti anticorpi secondari alla concentrazione finale di 4μg/ml:
immunoglobuline
di
capra
anti-ratto
coniugate
con
AlexaFluor®546
e
immunoglobuline di capra anti-coniglio o anti-topo coniugate con AlexaFluor®488
(Molecular Probes, Eugene, OR) per 1 ora a temperatura ambiente. Per la
visualizzazione di anticorpi primari biotinilati è stata usata una streptavidina
coniugata con AlexaFluor®488 (Molecular Probes, Eugene, OR) con le stesse
condizioni di utilizzo esposte in precedenza.
Per misurare la perfusione vascolare, gli animali sono stati inoculati per via
endovenosa con 50μl/topo di dextran 70K-FITC (Invitrogen; soluzione stock 360µM)
- 43 -
5 min prima del sacrificio; in questo caso il destrano non necessita di essere rivelato
mediante l’aggiunta di anticorpi in quanto è già coniugato con un fluoroforo. Per
l’identificazione di cellule ipossiche nella prostata è stato usato il pimonidazolo
cloridrato (Hypoxyprobe-1; Chemicon International, Temecula, CA) somministrato
ai topi per via intraperitoneale circa 1 ora prima del sacrificio alla concentrazione di
100 mg/kg in soluzione salina.
Per colorare i nuclei è stato utilizzato ToPro3 Iodide (Molecular Probes, Eugene,
OR) diluito 1:1000 (concentrazione stock 1mM) incubato per 15 minuti a
temperatura ambiente. La scansione dei campioni è stata effettuata con un
microscopio confocale Zeiss LSM 510 (Zeiss, Jena, Germania) corredato di tre
sorgenti laser, Argon 488nm, Helium-Neon 543nm ed Helium-Neon 633nm,
rispettivamente. Tutte le immagini sono state ottenute mantenendo una sezione
ottica di 40μm con un obiettivo 20x. Tutti i parametri sono stati standardizzati ed
applicati a tutte le scansioni, per poter comparare i segnali ottenuti nei diversi
campioni.
La quantificazione delle aree in attiva proliferazione o ipossiche è stata ottenuta
mediante analisi con Adobe Photoshop 6 (Adobe Systems, San Jose, CA).
- 44 -
Tabella 2.
2 Anticorpi usati per immunoistochimica e fluorescenza
Specie
Condizioni di utilizzo
Riferimento
anti-CD31
ratto
1:50; overnight; +4°C
(Becton-Dickinson, San Josè, CA)
anti-GBP-1
topo
1:100; 1h; temperatura
ambiente
(Lubeseder-Martellato et al., 2002)
anti-MxA
topo
1:100; 1h; temperatura
ambiente
(Flohr et al., 1999)
anti-Ki67
coniglio
1:200; 1h; temperatura
ambiente
(Novocastra, Newcastle Upon
Tyne,UK)
anti-caspasi3
attivata
coniglio
1:100; overnight; +4°C (Cell Signaling Tech., Danvers, MA)
anti-IFI204
coniglio
1:100; 1h; temperatura
ambiente
(Gariglio et al., 2002)
anti F4/80
ratto
1:100; overnight; +4°C
(Invitrogen, Groningen, Olanda)
anti-CD45
biotinilato
-
1:100; overnight; +4°C
(Becton-Dickinson, San Josè, CA)
anti-muIFN-α
ratto
1:100; overnight; +4°C (Hycult biotechnology, Uden, Olanda)
Analisi statistica
Tutti i risultati sono stati espressi come Media ± Deviazione Standard. I dati sono
stati analizzati con il software SPSS13 (SPSS Inc., Chicago, IL) mediante l’utilizzo del
test t di Student o Mann-Whitney, ove opportuno. Per valutare la correlazione tra i
risultati di immunoistochimica per GBP-1 e MxA sono stati usati il Fisher’s exact test
e il coefficiente di correlazione di Pearson. In tutti i test eseguiti, le differenze sono
state considerate statisticamente significative se P<0.05.
- 45 -
RISULTATI
Studio dell’angiogenesi durante la progressione tumorale nel modello TRAMP
Allo scopo di elucidare le dinamiche dei cambiamenti vascolari durante la
tumorigenesi, sono stati sacrificati dei topi TRAMP affetti da carcinoma prostatico a
diverso stadio di progressione neoplastica, è stata prelevata la prostata e
successivamente analizzata in immunoistochimica con un anticorpo anti-CD31 per il
calcolo della IMVD. Come mostrato in Figura 9, la prostata derivante da animali non
transgenici (NT) non ha presentato vasi intra-duttali, al contrario questi sono
presenti all’interno degli acini ghiandolari già in lesioni intraepiteliali (PIN) e in
tutte le fasi successive di progressione tumorale. I vasi intra-duttali sono presenti sin
dalle prime lesioni pre-neoplastiche (PIN) e il loro numero aumenta gradualmente
nelle lesioni ben differenziate (WD) fino al carcinoma scarsamente differenziato o
indifferenziato (PD) (Figura 10A).
- 46 -
Figura 9
Figura 9.
9 Immagini rappresentative di sezioni prostatiche derivanti da topi C57/Bl6 non transgenici
(NT), e da topi TRAMP che presentavano PIN e carcinoma WD o PD, colorate con un anticorpo antiCD31; le frecce indicano i vasi inter-duttali (NT) e quelli intra-duttali (PIN); ingrandimento 400x.
Queste variazioni dell’architettura vascolare nelle lesioni neoplastiche dei topi
TRAMP sono accompagnate da un chiaro incremento dell’espressione del VEGF a
partire dalla 8° settimana di età, momento il cui è già stata descritta l’attivazione
dello switch angiogenico in questo modello (Huss et al., 2001a); inoltre, le prostate
dei topi TRAMP in esame hanno mostrato un progressivo aumento di un'altra
molecola pro-angiogenica come il bFGF, ma solo durante le fasi più tardive della
progressione neoplastica (Figura 10B).
- 47 -
Figura 10
Figura 10.
10 Valutazione dell’angiogenesi durante la progressione tumorale nel modello TRAMP. A. Il
grafico mostra i valori di IMVD calcolati a differenti stadi della progressione tumorale; sono stati
analizzati almeno 6 campioni per gruppo. B. I livelli di espressione di VEGF e bFGF sono stati
analizzati mediante real-time PCR su RNA estratto da topi TRAMP di età compresa tra 5 e 33
settimane; sono stati analizzati almeno 4 campioni per gruppo. * P<0.05, n.s=non significativo.
Poiché l’espressione endogena di IFN-α durante la progressione neoplastica nei
tumori derivanti dal topo TRAMP non è nota, ci siamo interessati allo studio dei
geni di cui è riconosciuta l’induzione da parte di IFN-α, valutandone l’espressione
nel tempo in funzione della progressione tumorale. I risultati ottenuti (Figura 11)
indicano che molti dei geni regolati da IFN-α tra cui le chemochine angiostatiche
CXCL10, CXCL11, e GBP-1 e IFI204 sono espressi inizialmente a bassi livelli per poi
aumentare durante le fasi successive di progressione, nei tumori più avanzati. Per
investigare i possibili meccanismi di attivazione di questi geni nei tumori più
avanzati presi in esame, abbiamo valutato la possibile presenza di un infiltrato
infiammatorio in queste lesioni. La marcatura con degli anticorpi anti-CD45, antiF4/80, anti-CD4 e anti-CD8 ha mostrato una maggior presenza di queste popolazioni
leucocitarie nelle fasi più avanzate rispetto alle lesioni iniziali (Figura 12). La
produzione di IFN-α da parte di queste cellule infiammatorie potrebbe spiegare
- 48 -
l’aumentata espressione dei geni regolati da IFN durante le fasi più avanzate della
neoplasia.
Figura 11
Figura 11
11. Cinetica di espressione di geni regolati da IFN-α durante la progressione neoplastica nel
topo TRAMP. L’espressione di CXCL10-11, TRAIL, GBP-1 e IFI204 è stata valutata mediante realtime PCR e normalizzata sull’espressione di GAPDH, G6PDH e RPII; sono stati valutati almeno 4
campioni per gruppo. * P<0.05.
- 49 -
Figura 12
Figura 12.
12 Presenza di infiltrato infiammatorio nelle fasi più avanzate della neoplasia prostatica nel
modello TRAMP. Immagini rappresentative degli stainings con anticorpi anti-CD45, F4/80, CD4 e
CD8 (verde). Durante la progressione tumorale si assiste ad un graduale aumento dell’infiltrato
leucocitario soprattutto durante le fasi più avanzate della neoplasia; ingrandimento 200x.
Valutazione del trasferimento genico in vivo e degli effetti biologici mediati da
IFNIFN-α.
Inizialmente topi TRAMP di 6 settimane di età sono stati inoculati con un vettore
lentivirale codificante per il gene reporter EGFP (CMV-EGFP) e sacrificati dopo una
- 50 -
settimana per la valutazione della biodistribuzione del vettore mediante real-time
PCR della sequenza dell’EGFP sul DNA genomico estratto dai tessuti. Come
mostrato in Figura 13A la presenza del gene EGFP è stata individuata in fegato,
milza, prostata, peritoneo e polmoni dei topi trattati con CMV-EGFP. Il transgene è
stato riscontrato principalmente nel fegato (da 1.47% a 26.43%) e nella milza (da
0.17% a 18.18%), organi che plausibilmente rappresentano la fonte primaria di
espressione del transgene. La percentuale di cellule trasdotte nella prostata è risultata
essere di gran lunga inferiore rispetto agli organi sopra elencati (da 0.12% a 0.85%),
ma allo stesso tempo significativamente superiore rispetto alle percentuali di cellule
EGFP+ rilevate in altri tessuti quali peritoneo e polmoni (Figura 13A). Questi
risultati indicano chiaramente che questa tipologia di vettori lentivirali è in grado di
raggiungere e trasdurre la prostata dei topi TRAMP, anche se a bassi livelli se
confrontati con le percentuali di trasduzione ottenute in fegato e milza.
Una volta verificata la biodistribuzione dei vettori, è stato allestito un
esperimento che prevedeva l’utilizzo dei vettori codificanti il gene terapeutico. A
questo scopo, topi TRAMP di 6 settimane sono stati inoculati con il vettore LV-IFN
e successivamente è stata valutata l’espressione del transgene. L’espressione del gene
IRF-7, che è noto per essere un sensibile indicatore dell’espressione di IFN-α nei
modelli murini (Indraccolo et al., 2006), è risultata essere up-regolata in modo
significativo (fold 4-12) nei leucociti circolanti (peripheral blood mononuclear cells;
PBMC) rispetto all’espressione rilevata nei topi di controllo fino a 14 settimane
dall’inoculo del vettore (Figura 13B). In accordo con gli studi precedenti in cui
venivano utilizzati questi vettori (Indraccolo et al., 2005), i livelli di produzione
sistemica di IFN-α erano molto bassi (<12.5pg/ml) e non è stata osservata alcuna
evidente tossicità riconducibile all’espressione del transgene.
- 51 -
Per confermare l’avvenuta infezione da parte dei vettori lentivirali e l’effettiva
espressione del transgene, abbiamo valutato l’espressione dell’IFN-α murino in
sezioni di fegato dei topi trattati o di controllo. L’IFN-α è risultato espresso nel
fegato dei topi trattati e non in quelli di controllo (Figura 13C pannelli superiori) e
allo stesso modo anche l’MxA, uno dei geni noti per essere indotti da IFN-α, è molto
più espresso nel fegato dei topi TRAMP trattati con LV-IFN rispetto a quelli di
controllo (Figura 13C pannelli inferiori).
- 52 -
Figura 13
Figura 13
13. Biodistribuzione delle sequenze virali negli organi dei topi TRAMP ed espressione del
trangene mediata da LV-IFN. A. A distanza di una settimana dal trattamento con LV-EGFP i topi
sono stati sacrificati ed è stato estratto il DNA genomico dagli organi presi in considerazione. Il
calcolo della percentuale di cellule EGFP+ è stato effettuato mediante real-time PCR delle sequenze
del transgene sul DNA genomico estratto dai tessuti. Le barre rosse indicano la mediana calcolata per
ogni gruppo; sono stati valutati 6 topi per gruppo. B. Up-regolazione dell’espressione del gene IRF-7
nei PBMC dei topi trattati con LV-IFN. La linea rossa indica l’espressione di IRF-7 rilevata nei topi
non trattati; analizzati almeno 10-12 topi per gruppo. C. Valutazione dell’espressione di muIFN-α nel
fegato dei topi dopo trattamento con LV-IFN. Nel fegato dei topi trattati vi è una maggiore
espressione di muIFN-α e di un gene regolato da IFN-α come MxA; ingrandimento 200x.
- 53 -
I topi trattati con LV-IFN e quelli di controllo sono stati quindi sacrificati a
diverse settimane dall’inoculo dei vettori ed è stata valutata l’espressione di un
pannello di geni indotti da IFN-α che erano stati precedentemente individuati nel
nostro laboratorio mediante analisi della signature di IFN-α nelle cellule endoteliali
(Indraccolo et al., 2007). A conferma dei dati di espressione ottenuti nei PBMC, la
valutazione dell’espressione di IRF-7 nella prostata ne ha mostrato l’up-regolazione
rispetto ai controlli (Figura 14A). Oltre all’espressione di IRF-7 sono stati valutati
anche IFIT-1, IFI27, Mx1-2, IFI204, CXCL10-11, GBP-1 e TRAIL; l’espressione di
tutti questi trascritti è risultata modulata in senso positivo dal trattamento con LVIFN a tempi di analisi ravvicinati e, ad eccezione di IFI204 e Mx1-2, è risultata
progressivamente ridotta a 14 settimane di distanza dall’inoculo del vettore (Figura
14B).
- 54 -
Figura 14
Figura 14.
14 A-B. Espressione dei geni regolati da IFN-α nella prostata dei topi TRAMP. I topi TRAMP
sono stati sacrificati 1, 3, 6 e 14 settimane dall’inoculo di LV-IFN ed è stata valutata l’espressione di
IRF-7, IFIT-1, IFI27, Mx1-2, IFI204, CXCL10-11, GBP-1, TRAIL, VEGF e bFGF mediante real-time
PCR nei topi trattati rispetto ai controlli (linea rossa); almeno 6 topi per gruppo. * P<0.05. C. Analisi
in immunofluorescenza dell’espressione di IFI204 e MxA. A una settimana dall’inoculo di LV-IFN,
sezioni di prostata da topi trattati o di controllo sono state marcate con anticorpi anti-IFI204 o anti
MxA (verde); up-regolazione dell’espressione delle 2 proteine nei topi trattati rispetto ai controlli.
Ingrandimento 200x.
I livelli di VEGF non sono stati sostanzialmente perturbati dal trattamento con
IFN-α, mentre il trascritto del bFGF è stato moderatamente down-regolato, anche se
in modo significativo, solo a 14 settimane dal trattamento (Figura 14B). Per
- 55 -
confermare i dati di espressione dei geni indotti da IFN-α, è stata valutata
l’espressione di IFI204 ed MxA anche a livello proteico; l’analisi al microscopio
confocale ha mostrato una chiara differenza nell’intensità di espressione delle 2
proteine nella prostata dei topi trattati rispetto ai controlli (Figura 14C), a conferma
dei dati ottenuti con l’analisi dei trascritti.
L’espressione di IFNIFN-α inibisce l’angiogenesi e la proliferazione cellulare nei
tumori prostatici.
L’up-regolazione delle chemochine angiostatiche CXCL10 e CXCL11, assieme alla
modesta inibizione dell’espressione del bFGF, potevano indicare un possibile effetto
dell’IFN-α sull’angiogenesi. Per effettuere questo tipo di analisi topi TRAMP trattati
o meno con LV-IFN sono stati sacrificati a 14 settimane dal trattamento e le sezioni
di prostata sono state analizzate mediante immunoistochimica con un anticorpo
anti-CD31 specifico per gli endoteli ed è stata calcolata l’IMVD. La densità vascolare
intraduttale è risultata ridotta del 50% nei tumori trattati rispetto ai controlli (5,05 e
2,54 rispettivamente; Figura 15A) indicando che il trattamento è stato in grado di
inibire la formazione di neo-vasi, sebbene non sia riuscito a bloccare completamente
lo switch angiogenico. Inoltre, l’analisi della presenza di periciti effettuata in
immunofluorescenza mediante l’utilizzo di un anticorpo contro il proteoglicano
condroitin-solfato NG2, che è noto essere espresso dai periciti, ha evidenziato una
differenza significativa tra gli animali trattati ed i controlli (Figura 15B); la
percentuale di vasi coperti da periciti nella prostata di topi trattati con IFN-α è
risultata maggiore rispetto ai topi controllo (90.11% e 65.53% rispettivamente) e
simile alla percentuale calcolata per la prostata di topi C57Bl/6 della stessa età
(92.08%), indicando che l’IFN-α è stato in grado di promuovere la maturazione
vascolare. In relazione a questi effetti, l’espressione di angiopoietina 1, un fattore
- 56 -
angiogenico in grado di promuovere il rimodellamento e la maturazione vascolare
(Jain, 2003), è risultata up-regolata nella prostata dei topi trattati (Figura 15B) e
potrebbe contribuire alla normalizzazione vascolare da parte di questa citochina.
Figura 14
Figura 15
15. A. Riduzione dell’IMVD nella prostata dei topi trattati con IFN-α. L’analisi è stata
effettuata mediante immunoistochimica con un anticorpo anti-CD31 su campioni di prostata a 14
settimane dal trattamento con i vettori lentivirali (IMVD è stata calcolata come descrirro nei
Materiali e Metodi); 12 animali per gruppo, ingrandimento 200x. B. Le stesse sezioni sono state
marcate con gli anticorpi anti-CD31 (rosso) e anti-NG2 (verde) e analizzate mediante microscopia
confocale. Nei pannelli superiori sono riportate immagini rappresentative dello staining per i periciti
nei topi controllo, trattati con LV-IFN o topi non transgenici; ingrandimento 200x. Nei pannelli
inferiori sono riportati degli ingrandimenti (400x) di vasi selezionati (sinistra) e la valutazione
dell’espressione di angiopoietina-1 mediante real-time PCR. * P<0.05.
- 57 -
Infine, la vascolatura è stata analizzata anche dal punto di vista della perfusione,
mediante l’inoculo per via endovenosa del tracciante fluorescente Dextran 70KFITC. L’analisi al microscopio confocale non ha evidenziato differenze significative
tra i topi trattati e non con LV-IFN e ha mostrato che durante queste prime fasi di
progressione tumorale l’indice di perfusione è molto elevato e si assesta per entrambi
i gruppi attorno al 65% (Figura 16A). In linea con queste osservazioni anche la
valutazione della presenza di aree ipossiche mediante marcatura con un anticorpo
che riconosce i prodotti di riduzione del pimonidazolo, molecola che subisce una
riduzione in presenza di bassa tensione di ossigeno, nei tessuti prostatici ha
dimostrato la scarsa presenza di aree ipossiche (<5%) e nessuna differenza tra i due
gruppi sperimentali (Figura 16B).
Figura 16
Figura 16.
16 A. Analisi della perfusione vascolare in topi trattati e di controllo. I vasi sono visualizzati
mediante un anticorpo anti-CD31 (rosso), mentre i vasi perfusi presentano anche la colorazione con il
Destrano 70K-FITC (verde); almeno 6 animali per gruppo analizzati, ingrandimento 200x. B. Analisi
della presenza di aree ipossiche mediante marcatura del pimonidazolo (rosso); almeno 6 animali per
gruppo analizzati, ingrandimento 200x.
- 58 -
Questi effetti sull’angiogenesi sono accompagnati da una marcata inibizione della
proliferazione cellulare, valutata mediante marcatura con un anticorpo anti-Ki67
(Figura 17A). La riduzione della positività per il Ki67 è stata evidenziata già a 3
settimane dall’inoculo del vettore LV-IFN (Figura 17A; pannelli superiori) ed è
mantenuta fino a 14 settimane dal trattamento (Figura 17A; pannelli inferiori).
Tuttavia il trattamento non ha influenzato in generale la percentuale di aree di PIN
o WD presenti nei tessuti prostatici trattati rispetto ai controlli (40.9 ± 28.7 e 46.8 ±
28.1 rispettivamente).
La presenza di cellule apoptotiche è stata evidenziata mediante una anticorpo
anti-caspasi 3, ma il loro numero è risultato essere estremamente basso e
sostanzialmente comparabile nella prostata dei topi trattati con IFN-α rispetto ai
controlli (Figura 17B).
Anche i livelli di espressione della ciclina D2, un regolatore del ciclo cellulare
coinvolto nella progressione del carcinoma prostatico (Sun et al., 2008), sono risultati
significativamente ridotti nei topi trattati con IFN-α rispetto ai controlli in
concomitanza con l’up-regolazione dell’espressione di p16 (Figura 17C), un
regolatore chiave della ciclina D2 (Busk et al., 2005). Questi risultati indicano che
ciclina D2 e p16 possono, almeno in parte, mediare gli effetti antiproliferativi
dell’IFN-α in questo modello e confermano, anche a livello trascrizionale, l’effetto
inibitorio di questa citochina sulla proliferazione delle cellule prostatiche in vivo.
- 59 -
Figura 17
Figura 17.
17 A. Analisi della proliferazione cellulare mediante marcatura con Ki67 (verde) a 3 settimane
(pannelli superiori) e 14 settimane dal trattamento (pannelli inferiori); 6-10 animali per gruppo,
ingrandimento 200x. B. Analisi della presenza di cellule apoptotiche mediante analisi della caspasi 3
(verde); 6-8 animali per gruppo, ingrandimento 200x; n.s.: non significativo. C. Valutazione
dell’espressione della ciclina D2 e p16 a 3, 6 e 14 settimane dei topi trattati con LV-IFN rispetto ai
controlli (linea rossa) mediante PCR quantitativa; 3-6 animali per gruppo. * P<0.05.
- 60 -
Espressione di proteine indotte da IFNIFN-α in campioni di carcinoma prostatico
umano.
Alla luce dei marcati effetti biologici di IFN-α riscontrati nel modello TRAMP,
abbiamo trovato interessante investigare se nei campioni di carcinoma prostatico
umano potesse essere presente un’espressione di IFN-α endogeno e se questo
correlasse in qualche modo con la stadiazione o l’andamento clinico dei pazienti in
esame. A questo scopo, abbiamo considerato il fatto che il GBP-1 umano (hGBP-1) è
una tra le proteine più abbondantemente espresse nelle cellule dopo trattamento con
IFN-α (Cheng et al., 1983). Poiché i trascritti del GBP-1 murino erano risultati upregolati nella prostata dei topi TRAMP trattati con IFN-α, abbiamo ritenuto che
hGBP-1 potesse rappresentare un possibile marker dell’espressione di IFN-α
endogeno nei campioni dei pazienti. I diversi campioni sono stati pertanto analizzati
in immunoistochimica per la presenza di questa proteina mediante l’utilizzo di un
anticorpo monoclonale in grado di riconoscere la forma umana del GBP-1
(Lubeseder-Martellato et al., 2002). Dopo colorazione abbiamo ottenuto 2 diversi
pattern di espressione di hGBP-1 in 13 su 31 campioni di carcinoma prostatico
umano analizzati (Figura 18 e Tabella 3). 7 campioni hanno mostrato positività a
livello delle cellule epiteliali, mentre altri 6 sono risultati positivi focalmente a
livello stromale (cellule endoteliali e infiltrato leucocitario). In alcuni campioni
anche le cellule basali delle ghiandole prostatiche normali hanno mostrato una
reattività per GBP-1, anche in assenza di evidente infiammazione tissutale. Tuttavia,
le differenze di espressione del hGBP-1, non correlavano con il Gleason score, i
valori di PSA totale o la stadiazione clinica e/o chirurgica dei campioni (Tabella 3).
Inoltre, l’MxA, un altro gene regolato da IFN-α, è risultato espresso in 10 di 13
campioni GBP-1+ e in 4 su 10 campioni GBP-1-, dimostrando quindi una buona
- 61 -
correlazione con l’espressione di hGBP-1 e indicando che plausibilmente possa
essere l’IFN-α a coordinare l’espressione di queste proteine.
Figura 18
Figura 18.
18 Pattern di espressione di hGBP-1 ed MxA nei campioni di carcinoma prostatico umano.
All’immunoistochimica per hGBP-1 i campioni sono risultati negativi (A-B), positivi nello stroma
(cellule basali, E; infiltrato infiammatorio F) o anche nelle cellule tumorali (I-J). Anche l’MxA è
risultato negativo (C-D) in una serie di campioni, presente nello stroma (endoteli dei vasi, G;
infiltrato infiamatorio, H) o anche nel compartimento epiteliale (K-L); ingrandimento 400x.
- 62 -
Tabella 3.
3 Espressione di hGBP-1 in campioni di carcinoma prostatico umano
Campione
Età
PSA
totale
#1
#2
#3
#4
#5
#6
#7
#8
#9
#10
#11
#12
#13
#14
#15
#16
#17
#18
#19
#20
#21
#22
#23
#24
#25
#26
#27
#28
#29
#30
#31
61
58
63
57
71
61
53
47
59
68
61
64
65
56
71
60
71
69
62
71
61
51
71
72
70
76
66
64
51
54
61
7,02
7,28
9,1
5
8,45
7,2
7
13,6
4,7
4,1
2
4,7
18
1,8
3,69
6,43
18,1
13,75
47,5
6,46
14,3
18
6,71
4,5
6,8
4
8,1
35,2
5,1
10,9
10,56
Stadio
clinico
Gleason
score
pT
GBPGBP-1
MxA
T2a
T2a
T2a
T2a
T2a
T1c
T1c
T1c
T1c
T1c
T2a
T1c
T1c
T1a
T1b
T1c
T1c
T1c
T1c
T2a
T1c
T2b
T2a
T2a
T1c
T2a
T1c
T1c
T2a
T1c
T1c
7
9
8
7
9
7
7
7
5
6
7
7
6
5
7
7
8
8
9
8
7
7
8
7
0
7
7
7
9
7
9
pT3a
pT3a
pT3b
pT3a
pT3b
pT3b
pT3a
pT3a
pT2a
pT3a
pT3a
pT2c
pT2c
pT2c
pT3a
pT3a
pT3b
pT3a
pT3b
pT3a
pT3b
pT3a
pT3a
pT2c
pT3a
pT3a
pT2c
pT3a
pT3a
pT3a
pT3b
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
pos *
pos *
pos *
pos *
pos *
pos *
pos ^
pos ^
pos ^
pos ^
pos ^
pos ^
pos ^
pos ^
n.v.
pos ^
pos ^
neg
neg
pos *
neg
neg
neg
neg
neg
n.v.
n.v.
neg
n.v.
n.v.
n.v.
pos ^
neg
pos *
pos *
n.v.
pos ^
pos ^
neg
pos ^
pos *
pos *
pos ^
pos *
Dopo immunoistochimica i campioni sono stati valutati da due patologi indipendentemente in cieco;
pos: positivo; neg: negativo; n.v.: non valutato. * espressione nello stroma; ^ espressione nello stroma e
nelle cellule tumorali.
- 63 -
DISCUSSIONE
In questo studio si dimostra che il trattamento con IFN-α è in grado di contrastare
l’attivazione dell’angiogenesi nel modello di carcinoma prostatico TRAMP, in cui
questo evento avviene nelle fasi iniziali della tumorigenesi (Huss et al., 2001a).
Questa conclusione è supportata dalla marcata riduzione dei micro-vasi associati al
tumore nella prostata dei topi trattati con IFN-α e dall’aumento della presenza di
periciti associati alla vascolatura fino a valori molto simili a quelli presenti in topi
non transgenici, il che può indicare che l’ IFN-α è in grado di promuovere la
maturazione dei vasi; questa nuova attività degli interferoni di tipo I è stata
recentemente descritta fino ad ora solo in alcuni modelli di tumori xenotrapiantati
(De Palma et al., 2008; Dickson et al., 2007). Gli interferoni α e β sono già stati
utilizzati in passato per prevenire l’attivazione dell’angiogenesi nel modello RIP-Tag
di tumorigenesi spontanea del pancreas, anche se in combinazione con altri inibitori
dell’angiogenesi (Parangi et al., 1996), con effetti sovrapponibili a quelli ottenuti nel
nostro modello. Inoltre, i nostri risultati rinforzano ed estendono le conclusioni di
altri studi in cui è stata dimostrata l’inibizione della formazione di lesioni preneoplastiche in un modello di adenocarcinoma del fegato in ratto (Nakaji et al.,
- 64 -
2004) e sottolineano l’efficacia di questo tipo di trattamento nei primi steps di
progressione di diversi tumori.
Alla luce delle numerose attività che sono state descritte per gli interferoni di tipo
I (Borden et al., 2007), l’identificazione univoca dei meccanismi che sono alla base
degli effetti anti-angiogenici osservati nel modello TRAMP è molto complessa.
Innanzitutto, in questo modello lo switch angiogenico è stato associato in primo
luogo all’espressione del VEGF (Huss et al., 2001a), ma le analisi condotte indicano
che i livelli di questo trascritto nella prostata sono comparabili in entrambi i gruppi
sperimentali (Figura 14). Inoltre, altri studi hanno suggerito che anche il bFGF possa
contribuire alla progressione neoplastica nel modello TRAMP poichè è stato trovato
espresso già in lesioni pre-neoplastiche come nei tumori più avanzati (Huss et al.,
2003) e la sua parziale inattivazione genetica aumenta la sopravvivenza dei topi
TRAMP in esame (Polnaszek et al., 2003). Nei campioni di prostata analizzati, i
livelli di bFGF sono ridotti nella prostata dei topi trattati con LV-IFN rispetto ai
controlli, ma solo a 14 settimane dal trattamento. Sebbene la riduzione dei livelli di
bFGF possa in parte motivare l’inibizione dell’angiogenesi riscontrata in questi
campioni, il fatto che questa variazione si manifesti solo molto tempo dopo il
trattamento non ci può fare escludere che possa essere solo un evento secondario,
conseguente ad esempio alla riduzione della massa tumorale. Per contro, le analisi
dei livelli trascrizionali di chemochine angiostatiche quali CXCL10-11 e di GBP-1
nella prostata dei topi trattati con LV-IFN ne ha mostrato la marcata up-regolazione
già a breve distanza dal trattamento, rendendo plausibile pensare che siano loro i
mediatori primari degli effetti vascolari dell’IFN-α.
Accanto agli effetti sull’angiogenesi, l’altro effetto è stato l’inibizione della
proliferazione cellulare nei tessuti con PIN o WD. L’espressione di IFI204, un
- 65 -
mediatore di IFN-α al quale è stata associata un’azione antiproliferativa (Dauffy et
al., 2006), nonché l’up-regolazione di p16 e l’inibizione della ciclina D2
suggeriscono che il trattamento con LV-IFN possa avere degli effetti diretti di
inibizione della proliferazione cellulare. Tuttavia, il trattamento di 6 diverse linee
cellulari derivate da tumori TRAMP con IFN-α non ha mostrato un chiaro
rallentamento della proliferazione, e comunque nella maggior parte dei casi solo a
dosaggi elevati (Figura 19), indicando che in vivo questo potrebbe avvenire in modo
indiretto.
Figura 19
Figura 19.
19 Valutazione degli effetti diretti di IFN-α sulla proliferazione cellulare in linee cellulari di
carcinoma prostatico murino. Evidente inibizione della proliferazione della linea C2 e modesta
inibizione nelle linee C3 e T23, solo ad alte dosi di IFN-α; * P<0.05.
Meccanismi di controllo indiretto della proliferazione potrebbero essere mediati
da cellule dello stroma quali fibroblasti e cellule endoteliali; infatti è già stato
descritto che l’angiogenesi fisiologica è in grado di regolare la crescita dei tessuti
prostatici normali (Folkman, 1998) e che i fibroblasti associati al tumore sono in
- 66 -
grado di modulare il potenziale tumorale di cellule epiteliali prostatiche (Olumi et
al., 1999). Tuttavia, poichè il ruolo delle cellule stromali nel controllo della
proliferazione delle cellule tumorali nel modello TRAMP non è stato ancora
descritto queste ipotesi restano tali.
Gli interferoni di tipo I sono noti da molto tempo per la loro capacità di modulare
l’attività del sistema immunitario mediante stimolazione delle cellule dendritiche,
up-regolazione delle proteine MHC I, stimolazione della sopravvivenza di linfociti T,
e potenziamento della risposta umorale e della capacità citotossica delle cellule NK e
CD8+ (Belardelli et al., 2002). Per verificare se gli effetti del trattamento con LV-IFN
potessero essere mediati dalla stimolazione del sistema immunitario nel modello
TRAMP, abbiamo valutato l’eventuale aumento di infiltrazione leucocitaria nella
prostata dei topi trattati rispetto ai controlli. Nei topi TRAMP analizzati abbiamo
osservato solamente un lieve aumento dell’infiltrazione di cellule CD4+ o CD8+ solo
a 3 settimane dal trattamento e non a tempi successivi (Figura 20), indicando che i
meccanismi
di
risposta
all’IFN-α
mediati
dal
sistema
immunitario
non
contribuiscono verosimilmente agli effetti anti-angiogenici e anti-proliferativi
descritti.
- 67 -
Figura 20
Figura 20.
20 Valutazione dell’infiltrato leucocitario nella prostata. Modesto aumento della presenza di
cellule CD4+ (A-B; verde) e CD8+ (C-D; verde) nella prostata a 3 settimane dal trattamento con LVIFN. A tempi successivi di analisi l’infiltrazione da parte di queste cellule resta scarsa e comunque
comparabile tra i diversi gruppi sperimentali (E-H); ingrandimento 200x.
Per verificare la rilevanza clinica delle nostre osservazioni, abbiamo investigato la
possibile espressione di due geni regolati da IFN-α, GBP-1 ed MxA, in campioni di
carcinoma prostatico umano. Le informazioni riguardanti l’espressione di GBP-1 nei
tumori umani sono scarse (Naschberger et al., 2008), tuttavia è noto che la sua
espressione viene aumentata in aree di infiammazione che vengono spesso
riscontrate nei tumori (Lubeseder-Martellato et al., 2002; Naschberger et al., 2005;
Naschberger et al., 2006). Nei campioni di carcinoma prostatico umano analizzati
abbiamo confermato queste osservazioni abbiamo trovato GBP-1; inoltre, abbiamo
riscontrato l’espressione di GBP-1 in aree che non presentavano evidenti segni di
infiammazione tra cui cellule epiteliali tumorali e cellule basali di ghiandole anche
normali. Questo dato è molto interessante per il fatto che fino ad oggi l’espressione
- 68 -
di GBP-1 in vivo era stata associata quasi esclusivamente alle cellule endoteliali dove
questa può espletare una funzione specifica di inibizione proliferativa in risposta al
trattamento con interferoni di tipo I e altre citochine infiammatorie (Guenzi et al.,
2003; Lubeseder-Martellato et al., 2002; Nakaji et al., 2004; Naschberger et al., 2005).
Non sappiamo se l’espressione di GBP-1 nel carcinoma prostatico sia sostenuta dalla
presenza di IFN-α endogeno. In ogni caso, il fatto che circa il 70% dei campioni che
esprimono il GBP-1 sono positivi anche per MxA suggerisce che la loro espressione
possa dipendere dalla produzione di IFN-α endogeno. Inoltre, l’analisi effettuata su
dati di microarray depositati in un database pubblico (Gene Expression Omnibus;
GEO) indicano l’espressione coordinata di GBP-1 e di una serie di altri geni indotti
da IFN-α (Figura 21) in campioni di carcinoma prostatico (Varambally et al., 2002),
supportando quindi l’ipotesi che l’espressione di GBP-1 possa riflettere la presenza di
IFN-α endogeno. Dall’analisi della signature di IFN-α in questi campioni emerge
anche una significativa riduzione dei livelli di questi trascritti durante le fasi più
avanzate
di
progressione
neoplastica
(Figura
21),
suggerendo
un
ruolo
dell’espressione di questi geni nel contenimento della progressione tumorale nel
carcinoma prostatico.
- 69 -
Figura 21
Figura 21.
21 Espressione coordinata di una serie di trascritti indotti da IFN-α in campioni di carcinoma
prostatico a diverso stadio di progressione. I livelli di espressione di questi geni della signature dell’
IFN-α sono significativamente ridotti durante le fasi più avanzate di progressione neoplastica; *
P<0.05.
Il meccanismo alla base dell’attivazione della risposta all’IFN-α in questi campioni
non è noto, comunque un fenomeno simile è stato recentemente descritto anche in
circa il 32% di una serie di campioni di carcinoma colorettale (Naschberger et al.,
2008), nei quali è stato associato ad una risposta immune di tipo Th-1, che potrebbe
essere presente anche nel carcinoma prostatico. In ogni caso, il limitato numero di
casi analizzati nel nostro studio non ci permette di trarre delle conclusioni definitive
sulla correlazione tra l’espressione della signature di IFN-α e l’andamento dei
pazienti in questione, ma fornisce un razionale per l’analisi di un gruppo più
numeroso di campioni sui quali valutare la rilevanza prognostica dell’espressione
della signature di IFN-α.
Infine, la descrizione degli effetti biologici associati al trattamento con IFN-α nel
modello TRAMP potrebbe avere dei risvolti traslazionali. Infatti circa un quarto dei
nuovi casi di carcinoma prostatico vengono diagnosticati in cluster familiari e circa il
9% sono riconducibili a forme di carcinoma prostatico ereditario in funzione di loci
- 70 -
genici associati alla suscettibilità di insorgenza del carcinoma prostatico (Shand and
Gelmann, 2006). Poiché lo switch angiogenico è stato identificato anche nel PIN
umano (Pallares et al., 2006) e in altre lesioni pre-neoplastiche (Viacava et al., 2004),
il fatto che tale evento possa essere contrastato dall’IFN-α in un modello di
tumorigenesi prostatica potrebbe contribuire in futuro allo sviluppo di terapie di
profilassi con IFN-α o con altri inibitori dell’angiogenesi in pazienti ad alto rischio.
- 71 -
BIBLIOGRAFIA
Abate-Shen, C., and Shen, M. M. (2000). Molecular genetics of prostate cancer. Genes Dev 14, 24102434.
Abate-Shen, C., and Shen, M. M. (2002). Mouse models of prostate carcinogenesis. Trends Genet 18,
S1-5.
Ahmad, I., Sansom, O. J., and Leung, H. Y. (2008). Advances in mouse models of prostate cancer.
Expert Rev Mol Med 10, e16.
Al-Maghrabi, J., Vorobyova, L., Chapman, W., Jewett, M., Zielenska, M., and Squire, J. A. (2001). p53
Alteration and chromosomal instability in prostatic high-grade intraepithelial neoplasia and
concurrent carcinoma: analysis by immunohistochemistry, interphase in situ hybridization, and
sequencing of laser-captured microdissected specimens. Mod Pathol 14, 1252-1262.
Albini, A., Marchisone, C., Del Grosso, F., Benelli, R., Masiello, L., Tacchetti, C., Bono, M.,
Ferrantini, M., Rozera, C., Truini, M., et al. (2000). Inhibition of angiogenesis and vascular tumor
growth by interferon-producing cells: A gene therapy approach. Am J Pathol 156, 1381-1393.
Arteaga, C. L. (2006). EGF receptor mutations in lung cancer: from humans to mice and maybe back
to humans. Cancer Cell 9, 421-423.
Asahara, T., Murohara, T., Sullivan, A., Silver, M., van der Zee, R., Li, T., Witzenbichler, B.,
Schatteman, G., and Isner, J. M. (1997). Isolation of putative progenitor endothelial cells for
angiogenesis. Science 275, 964-967.
Becker, C. M., Farnebo, F. A., Iordanescu, I., Behonick, D. J., Shih, M. C., Dunning, P.,
Christofferson, R., Mulligan, R. C., Taylor, G. A., Kuo, C. J., and Zetter, B. R. (2002). Gene therapy of
prostate cancer with the soluble vascular endothelial growth factor receptor Flk1. Cancer Biol Ther 1,
548-553.
Belardelli, F., Ferrantini, M., Proietti, E., and Kirkwood, J. M. (2002). Interferon-alpha in tumor
immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev 13, 119-134.
- 72 -
Bergers, G., and Benjamin, L. E. (2003). Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer 3,
401-410.
Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T. H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P.,
Itohara, S., Werb, Z., and Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic
switch during carcinogenesis. Nat Cell Biol 2, 737-744.
Bertolini, F., Shaked, Y., Mancuso, P., and Kerbel, R. S. (2006). The multifaceted circulating
endothelial cell in cancer: towards marker and target identification. Nat Rev Cancer 6, 835-845.
Bigler, S. A., Deering, R. E., and Brawer, M. K. (1993). Comparison of microscopic vascularity in
benign and malignant prostate tissue. Hum Pathol 24, 220-226.
Bisacchi, D., Benelli, R., Vanzetto, C., Ferrari, N., Tosetti, F., and Albini, A. (2003). Anti-angiogenesis
and angioprevention: mechanisms, problems and perspectives. Cancer Detect Prev 27, 229-238.
Borden, E. C., Sen, G. C., Uze, G., Silverman, R. H., Ransohoff, R. M., Foster, G. R., and Stark, G. R.
(2007). Interferons at age 50: past, current and future impact on biomedicine. Nat Rev Drug Discov 6,
975-990.
Borgstrom, P., Bourdon, M. A., Hillan, K. J., Sriramarao, P., and Ferrara, N. (1998). Neutralizing antivascular endothelial growth factor antibody completely inhibits angiogenesis and growth of human
prostate carcinoma micro tumors in vivo. Prostate 35, 1-10.
Bostwick, D. G., Ramnani, D., and Qian, J. (2000). Prostatic intraepithelial neoplasia: animal models
2000. Prostate 43, 286-294.
Brawer, M. K., Deering, R. E., Brown, M., Preston, S. D., and Bigler, S. A. (1994). Predictors of
pathologic stage in prostatic carcinoma. The role of neovascularity. Cancer 73, 678-687.
Brown, L. F., Berse, B., Jackman, R. W., Tognazzi, K., Manseau, E. J., Dvorak, H. F., and Senger, D. R.
(1993). Increased expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) and
its receptors in kidney and bladder carcinomas. Am J Pathol 143, 1255-1262.
Busk, P. K., Hinrichsen, R., Bartkova, J., Hansen, A. H., Christoffersen, T. E., Bartek, J., and Haunso,
S. (2005). Cyclin D2 induces proliferation of cardiac myocytes and represses hypertrophy. Exp Cell
Res 304, 149-161.
Buttyan, R., Sawczuk, I. S., Benson, M. C., Siegal, J. D., and Olsson, C. A. (1987). Enhanced expression
of the c-myc protooncogene in high-grade human prostate cancers. Prostate 11, 327-337.
- 73 -
Cairns, P., Okami, K., Halachmi, S., Halachmi, N., Esteller, M., Herman, J. G., Jen, J., Isaacs, W. B.,
Bova, G. S., and Sidransky, D. (1997). Frequent inactivation of PTEN/MMAC1 in primary prostate
cancer. Cancer Res 57, 4997-5000.
Callahan, R. (1996). MMTV-induced mutations in mouse mammary tumors: their potential relevance
to human breast cancer. Breast Cancer Res Treat 39, 33-44.
Carmeliet, P., Dor, Y., Herbert, J. M., Fukumura, D., Brusselmans, K., Dewerchin, M., Neeman, M.,
Bono, F., Abramovitch, R., Maxwell, P., et al. (1998). Role of HIF-1alpha in hypoxia-mediated
apoptosis, cell proliferation and tumour angiogenesis. Nature 394, 485-490.
Carter, B. S., Bova, G. S., Beaty, T. H., Steinberg, G. D., Childs, B., Isaacs, W. B., and Walsh, P. C.
(1993). Hereditary prostate cancer: epidemiologic and clinical features. J Urol 150, 797-802.
Carter, B. S., Ewing, C. M., Ward, W. S., Treiger, B. F., Aalders, T. W., Schalken, J. A., Epstein, J. I.,
and Isaacs, W. B. (1990). Allelic loss of chromosomes 16q and 10q in human prostate cancer. Proc
Natl Acad Sci U S A 87, 8751-8755.
Chawla-Sarkar, M., Lindner, D. J., Liu, Y. F., Williams, B. R., Sen, G. C., Silverman, R. H., and
Borden, E. C. (2003). Apoptosis and interferons: role of interferon-stimulated genes as mediators of
apoptosis. Apoptosis 8, 237-249.
Chen, Q., Gong, B., Mahmoud-Ahmed, A. S., Zhou, A., Hsi, E. D., Hussein, M., and Almasan, A.
(2001). Apo2L/TRAIL and Bcl-2-related proteins regulate type I interferon-induced apoptosis in
multiple myeloma. Blood 98, 2183-2192.
Cheng, Y. S., Colonno, R. J., and Yin, F. H. (1983). Interferon induction of fibroblast proteins with
guanylate binding activity. J Biol Chem 258, 7746-7750.
Clarke, R. (1996). Animal models of breast cancer: their diversity and role in biomedical research.
Breast Cancer Res Treat 39, 1-6.
Conejo-Garcia, J. R., Benencia, F., Courreges, M. C., Kang, E., Mohamed-Hadley, A., Buckanovich, R.
J., Holtz, D. O., Jenkins, A., Na, H., Zhang, L., et al. (2004). Tumor-infiltrating dendritic cell
precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A.
Nat Med 10, 950-958.
Connolly, J. M., and Rose, D. P. (1998). Angiogenesis in two human prostate cancer cell lines with
differing metastatic potential when growing as solid tumors in nude mice. J Urol 160, 932-936.
- 74 -
Coussens, L. M., Raymond, W. W., Bergers, G., Laig-Webster, M., Behrendtsen, O., Werb, Z.,
Caughey, G. H., and Hanahan, D. (1999). Inflammatory mast cells up-regulate angiogenesis during
squamous epithelial carcinogenesis. Genes Dev 13, 1382-1397.
Dauffy, J., Mouchiroud, G., and Bourette, R. P. (2006). The interferon-inducible gene, Ifi204, is
transcriptionally activated in response to M-CSF, and its expression favors macrophage differentiation
in myeloid progenitor cells. J Leukoc Biol 79, 173-183.
De Marzo, A. M., Coffey, D. S., and Nelson, W. G. (1999). New concepts in tissue specificity for
prostate cancer and benign prostatic hyperplasia. Urology 53, 29-39; discussion 39-42.
De Palma, M., Mazzieri, R., Politi, L. S., Pucci, F., Zonari, E., Sitia, G., Mazzoleni, S., Moi, D.,
Venneri, M. A., Indraccolo, S., et al. (2008). Tumor-targeted interferon-alpha delivery by Tie2expressing monocytes inhibits tumor growth and metastasis. Cancer Cell 14, 299-311.
De Palma, M., Venneri, M. A., Galli, R., Sergi Sergi, L., Politi, L. S., Sampaolesi, M., and Naldini, L.
(2005). Tie2 identifies a hematopoietic lineage of proangiogenic monocytes required for tumor vessel
formation and a mesenchymal population of pericyte progenitors. Cancer Cell 8, 211-226.
Dickson, P. V., Hamner, J. B., Streck, C. J., Ng, C. Y., McCarville, M. B., Calabrese, C., Gilbertson, R.
J., Stewart, C. F., Wilson, C. M., Gaber, M. W., et al. (2007). Continuous delivery of IFN-beta
promotes sustained maturation of intratumoral vasculature. Mol Cancer Res 5, 531-542.
Dong, J. T., Rinker-Schaeffer, C. W., Ichikawa, T., Barrett, J. C., and Isaacs, J. T. (1996). Prostate
cancer--biology of metastasis and its clinical implications. World J Urol 14, 182-189.
Egevad, L., Granfors, T., Karlberg, L., Bergh, A., and Stattin, P. (2002). Prognostic value of the
Gleason score in prostate cancer. BJU Int 89, 538-542.
Feldman, E. D., Weinreich, D. M., Carroll, N. M., Burness, M. L., Feldman, A. L., Turner, E., Xu, H.,
and Alexander, H. R., Jr. (2006). Interferon gamma-inducible protein 10 selectively inhibits
proliferation and induces apoptosis in endothelial cells. Ann Surg Oncol 13, 125-133.
Ferrer, F. A., Miller, L. J., Andrawis, R. I., Kurtzman, S. H., Albertsen, P. C., Laudone, V. P., and
Kreutzer, D. L. (1997). Vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in human prostate
cancer: in situ and in vitro expression of VEGF by human prostate cancer cells. J Urol 157, 2329-2333.
- 75 -
Ferrer, F. A., Miller, L. J., Andrawis, R. I., Kurtzman, S. H., Albertsen, P. C., Laudone, V. P., and
Kreutzer, D. L. (1998). Angiogenesis and prostate cancer: in vivo and in vitro expression of
angiogenesis factors by prostate cancer cells. Urology 51, 161-167.
Flohr, F., Schneider-Schaulies, S., Haller, O., and Kochs, G. (1999). The central interactive region of
human MxA GTPase is involved in GTPase activation and interaction with viral target structures.
FEBS Lett 463, 24-28.
Fodde, R., Smits, R., Hofland, N., Kielman, M., and Meera Khan, P. (1999). Mechanisms of APCdriven tumorigenesis: lessons from mouse models. Cytogenet Cell Genet 86, 105-111.
Folkman, J. (1971). Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med 285, 1182-1186.
Folkman, J. (1992). The role of angiogenesis in tumor growth. Semin Cancer Biol 3, 65-71.
Folkman, J. (1995). Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat Med 1, 27-31.
Folkman, J. (1998). Is tissue mass regulated by vascular endothelial cells? Prostate as the first
evidence. Endocrinology 139, 441-442.
Folkman, J., and Klagsbrun, M. (1987). Angiogenic factors. Science 235, 442-447.
Folkman, J., and Shing, Y. (1992). Angiogenesis. J Biol Chem 267, 10931-10934.
Fukumura, D., Xavier, R., Sugiura, T., Chen, Y., Park, E. C., Lu, N., Selig, M., Nielsen, G., Taksir, T.,
Jain, R. K., and Seed, B. (1998). Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells. Cell 94,
715-725.
Funa, K., Nordgren, H., and Nilsson, S. (1991). In situ expression of mRNA for proto-oncogenes in
benign prostatic hyperplasia and in prostatic carcinoma. Scand J Urol Nephrol 25, 95-100.
Gariglio, M., Azzimonti, B., Pagano, M., Palestro, G., De Andrea, M., Valente, G., Voglino, G.,
Navino, L., and Landolfo, S. (2002). Immunohistochemical expression analysis of the human
interferon-inducible gene IFI16, a member of the HIN200 family, not restricted to hematopoietic
cells. J Interferon Cytokine Res 22, 815-821.
Gerber, H. P., McMurtrey, A., Kowalski, J., Yan, M., Keyt, B. A., Dixit, V., and Ferrara, N. (1998).
Vascular
endothelial
growth
factor
regulates
endothelial
cell
survival
through
the
phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR
activation. J Biol Chem 273, 30336-30343.
- 76 -
Gimbrone, M. A., Jr., Leapman, S. B., Cotran, R. S., and Folkman, J. (1973). Tumor angiogenesis: iris
neovascularization at a distance from experimental intraocular tumors. J Natl Cancer Inst 50, 219228.
Gleason, D. F. (1966). Classification of prostatic carcinomas. Cancer Chemother Rep 50, 125-128.
Gleason, D. F. (1992). Histologic grading of prostate cancer: a perspective. Hum Pathol 23, 273-279.
Glimcher, L. H., Townsend, M. J., Sullivan, B. M., and Lord, G. M. (2004). Recent developments in
the transcriptional regulation of cytolytic effector cells. Nat Rev Immunol 4, 900-911.
Greenberg, N. M., DeMayo, F., Finegold, M. J., Medina, D., Tilley, W. D., Aspinall, J. O., Cunha, G.
R., Donjacour, A. A., Matusik, R. J., and Rosen, J. M. (1995). Prostate cancer in a transgenic mouse.
Proc Natl Acad Sci U S A 92, 3439-3443.
Grunewald, M., Avraham, I., Dor, Y., Bachar-Lustig, E., Itin, A., Jung, S., Chimenti, S., Landsman, L.,
Abramovitch, R., and Keshet, E. (2006). VEGF-induced adult neovascularization: recruitment,
retention, and role of accessory cells. Cell 124, 175-189.
Guenzi, E., Topolt, K., Cornali, E., Lubeseder-Martellato, C., Jorg, A., Matzen, K., Zietz, C., Kremmer,
E., Nappi, F., Schwemmle, M., et al. (2001). The helical domain of GBP-1 mediates the inhibition of
endothelial cell proliferation by inflammatory cytokines. Embo J 20, 5568-5577.
Guenzi, E., Topolt, K., Lubeseder-Martellato, C., Jorg, A., Naschberger, E., Benelli, R., Albini, A., and
Sturzl, M. (2003). The guanylate binding protein-1 GTPase controls the invasive and angiogenic
capability of endothelial cells through inhibition of MMP-1 expression. Embo J 22, 3772-3782.
Gurel, B., Iwata, T., Koh, C. M., Yegnasubramanian, S., Nelson, W. G., and De Marzo, A. M. (2008).
Molecular alterations in prostate cancer as diagnostic, prognostic, and therapeutic targets. Adv Anat
Pathol 15, 319-331.
Hanahan, D., and Folkman, J. (1996). Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch
during tumorigenesis. Cell 86, 353-364.
Harden, S. V., Guo, Z., Epstein, J. I., and Sidransky, D. (2003). Quantitative GSTP1 methylation
clearly distinguishes benign prostatic tissue and limited prostate adenocarcinoma. J Urol 169, 11381142.
Harding, M. A., and Theodorescu, D. (1998). Prognostic markers in localized prostate cancer: from
microscopes to molecules. Cancer Metastasis Rev 17, 429-437.
- 77 -
Holash, J., Maisonpierre, P. C., Compton, D., Boland, P., Alexander, C. R., Zagzag, D., Yancopoulos,
G. D., and Wiegand, S. J. (1999). Vessel cooption, regression, and growth in tumors mediated by
angiopoietins and VEGF. Science 284, 1994-1998.
Hoosein, N. M., Boyd, D. D., Hollas, W. J., Mazar, A., Henkin, J., and Chung, L. W. (1991).
Involvement of urokinase and its receptor in the invasiveness of human prostatic carcinoma cell
lines. Cancer Commun 3, 255-264.
Huss, W. J., Barrios, R. J., Foster, B. A., and Greenberg, N. M. (2003). Differential expression of
specific FGF ligand and receptor isoforms during angiogenesis associated with prostate cancer
progression. Prostate 54, 8-16.
Huss, W. J., Hanrahan, C. F., Barrios, R. J., Simons, J. W., and Greenberg, N. M. (2001a). Angiogenesis
and prostate cancer: identification of a molecular progression switch. Cancer Res 61, 2736-2743.
Huss, W. J., Maddison, L. A., and Greenberg, N. M. (2001b). Autochthonous mouse models for
prostate cancer: past, present and future. Semin Cancer Biol 11, 245-260.
Indraccolo, S., Habeler, W., Tisato, V., Stievano, L., Piovan, E., Tosello, V., Esposito, G., Wagner, R.,
Uberla, K., Chieco-Bianchi, L., and Amadori, A. (2002). Gene transfer in ovarian cancer cells: a
comparison between retroviral and lentiviral vectors. Cancer Res 62, 6099-6107.
Indraccolo, S., Moserle, L., Tisato, V., Gola, E., Minuzzo, S., Roni, V., Persano, L., Chieco-Bianchi, L.,
and Amadori, A. (2006). Gene therapy of ovarian cancer with IFN-alpha-producing fibroblasts:
comparison of constitutive and inducible vectors. Gene Ther 13, 953-965.
Indraccolo, S., Pfeffer, U., Minuzzo, S., Esposito, G., Roni, V., Mandruzzato, S., Ferrari, N., Anfosso,
L., Dell'Eva, R., Noonan, D. M., et al. (2007). Identification of genes selectively regulated by IFNs in
endothelial cells. J Immunol 178, 1122-1135.
Indraccolo, S., Tisato, V., Tosello, V., Habeler, W., Esposito, G., Moserle, L., Stievano, L., Persano, L.,
Chieco-Bianchi, L., and Amadori, A. (2005). Interferon-alpha gene therapy by lentiviral vectors
contrasts ovarian cancer growth through angiogenesis inhibition. Hum Gene Ther 16, 957-970.
Isaacs, A., Lindenmann, J., and Valentine, R. C. (1957). Virus interference. II. Some properties of
interferon. Proc R Soc Lond B Biol Sci 147, 268-273.
Isaacs, J. T. (1994). Role of androgens in prostatic cancer. Vitam Horm 49, 433-502.
- 78 -
Isayeva, T., Chanda, D., Kallman, L., Eltoum, I. E., and Ponnazhagan, S. (2007). Effects of sustained
antiangiogenic therapy in multistage prostate cancer in TRAMP model. Cancer Res 67, 5789-5797.
Jain, R. K. (2003). Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med 9, 685-693.
Jensen, S. L., Wood, D. P., Jr., Banks, E. R., Veron, M., Lascu, I., McRoberts, J. W., and Rangnekar, V.
M. (1996). Increased levels of nm23 H1/nucleoside diphosphate kinase A mRNA associated with
adenocarcinoma of the prostate. World J Urol 14 Suppl 1, S21-25.
Kaplan-Lefko, P. J., Chen, T. M., Ittmann, M. M., Barrios, R. J., Ayala, G. E., Huss, W. J., Maddison, L.
A., Foster, B. A., and Greenberg, N. M. (2003). Pathobiology of autochthonous prostate cancer in a
pre-clinical transgenic mouse model. Prostate 55, 219-237.
Karayi, M. K., and Markham, A. F. (2004). Molecular biology of prostate cancer. Prostate Cancer
Prostatic Dis 7, 6-20.
Kirkwood, J. M., Richards, T., Zarour, H. M., Sosman, J., Ernstoff, M., Whiteside, T. L., Ibrahim, J.,
Blum, R., Wieand, S., and Mascari, R. (2002). Immunomodulatory effects of high-dose and low-dose
interferon alpha2b in patients with high-risk resected melanoma: the E2690 laboratory corollary of
intergroup adjuvant trial E1690. Cancer 95, 1101-1112.
Klein, D., Bugl, B., Gunzburg, W. H., and Salmons, B. (2000). Accurate estimation of transduction
efficiency necessitates a multiplex real-time PCR. Gene Ther 7, 458-463.
Kollermann, J., and Helpap, B. (2001). Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and
VEGF receptor Flk-1 in benign, premalignant, and malignant prostate tissue. Am J Clin Pathol 116,
115-121.
Kong, H. L., and Crystal, R. G. (1998). Gene therapy strategies for tumor antiangiogenesis. J Natl
Cancer Inst 90, 273-286.
Lissbrant, I. F., Stattin, P., Wikstrom, P., Damber, J. E., Egevad, L., and Bergh, A. (2000). Tumor
associated macrophages in human prostate cancer: relation to clinicopathological variables and
survival. Int J Oncol 17, 445-451.
Longnecker, D. S., Memoli, V., and Pettengill, O. S. (1992). Recent results in animal models of
pancreatic carcinoma: histogenesis of tumors. Yale J Biol Med 65, 457-464; discussion 465-459.
Lubeseder-Martellato, C., Guenzi, E., Jorg, A., Topolt, K., Naschberger, E., Kremmer, E., Zietz, C.,
Tschachler, E., Hutzler, P., Schwemmle, M., et al. (2002). Guanylate-binding protein-1 expression is
- 79 -
selectively induced by inflammatory cytokines and is an activation marker of endothelial cells during
inflammatory diseases. Am J Pathol 161, 1749-1759.
Lyden, D., Hattori, K., Dias, S., Costa, C., Blaikie, P., Butros, L., Chadburn, A., Heissig, B., Marks, W.,
Witte, L., et al. (2001). Impaired recruitment of bone-marrow-derived endothelial and hematopoietic
precursor cells blocks tumor angiogenesis and growth. Nat Med 7, 1194-1201.
Macintosh, C. A., Stower, M., Reid, N., and Maitland, N. J. (1998). Precise microdissection of human
prostate cancers reveals genotypic heterogeneity. Cancer Res 58, 23-28.
Madaan, S., Abel, P. D., Chaudhary, K. S., Hewitt, R., Stott, M. A., Stamp, G. W., and Lalani, E. N.
(2000). Cytoplasmic induction and over-expression of cyclooxygenase-2 in human prostate cancer:
implications for prevention and treatment. BJU Int 86, 736-741.
Nagabhushan, M., Pretlow, T. G., Guo, Y. J., Amini, S. B., Pretlow, T. P., and Sy, M. S. (1996). Altered
expression of CD44 in human prostate cancer during progression. Am J Clin Pathol 106, 647-651.
Nakaji, M., Yano, Y., Ninomiya, T., Seo, Y., Hamano, K., Yoon, S., Kasuga, M., Teramoto, T., Hayashi,
Y., and Yokozaki, H. (2004). IFN-alpha prevents the growth of pre-neoplastic lesions and inhibits the
development of hepatocellular carcinoma in the rat. Carcinogenesis 25, 389-397.
Naschberger, E., Bauer, M., and Sturzl, M. (2005). Human guanylate binding protein-1 (hGBP-1)
characterizes and establishes a non-angiogenic endothelial cell activation phenotype in inflammatory
diseases. Adv Enzyme Regul 45, 215-227.
Naschberger, E., Croner, R. S., Merkel, S., Dimmler, A., Tripal, P., Amann, K. U., Kremmer, E.,
Brueckl, W. M., Papadopoulos, T., Hohenadl, C., et al. (2008). Angiostatic immune reaction in
colorectal carcinoma: Impact on survival and perspectives for antiangiogenic therapy. Int J Cancer
123, 2120-2129.
Naschberger, E., Lubeseder-Martellato, C., Meyer, N., Gessner, R., Kremmer, E., Gessner, A., and
Sturzl, M. (2006). Human guanylate binding protein-1 is a secreted GTPase present in increased
concentrations in the cerebrospinal fluid of patients with bacterial meningitis. Am J Pathol 169,
1088-1099.
Nicholson, B., and Theodorescu, D. (2004). Angiogenesis and prostate cancer tumor growth. J Cell
Biochem 91, 125-150.
- 80 -
Nwosu, V., Carpten, J., Trent, J. M., and Sheridan, R. (2001). Heterogeneity of genetic alterations in
prostate cancer: evidence of the complex nature of the disease. Hum Mol Genet 10, 2313-2318.
Oliveira, I. C., Sciavolino, P. J., Lee, T. H., and Vilcek, J. (1992). Downregulation of interleukin 8
gene expression in human fibroblasts: unique mechanism of transcriptional inhibition by interferon.
Proc Natl Acad Sci U S A 89, 9049-9053.
Olumi, A. F., Grossfeld, G. D., Hayward, S. W., Carroll, P. R., Tlsty, T. D., and Cunha, G. R. (1999).
Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium.
Cancer Res 59, 5002-5011.
Ostrander, E. A., Kwon, E. M., and Stanford, J. L. (2006). Genetic susceptibility to aggressive prostate
cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 15, 1761-1764.
Pallares, J., Rojo, F., Iriarte, J., Morote, J., Armadans, L. I., and de Torres, I. (2006). Study of
microvessel density and the expression of the angiogenic factors VEGF, bFGF and the receptors Flt-1
and FLK-1 in benign, premalignant and malignant prostate tissues. Histol Histopathol 21, 857-865.
Paradis, V., Eschwege, P., Loric, S., Dumas, F., Ba, N., Benoit, G., Jardin, A., and Bedossa, P. (1998).
De novo expression of CD44 in prostate carcinoma is correlated with systemic dissemination of
prostate cancer. J Clin Pathol 51, 798-802.
Parangi, S., O'Reilly, M., Christofori, G., Holmgren, L., Grosfeld, J., Folkman, J., and Hanahan, D.
(1996). Antiangiogenic therapy of transgenic mice impairs de novo tumor growth. Proc Natl Acad Sci
U S A 93, 2002-2007.
Pepper, M. S., Ferrara, N., Orci, L., and Montesano, R. (1992). Potent synergism between vascular
endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in the induction of angiogenesis in vitro.
Biochem Biophys Res Commun 189, 824-831.
Persano, L., Crescenzi, M., and Indraccolo, S. (2007). Anti-angiogenic gene therapy of cancer: current
status and future prospects. Mol Aspects Med 28, 87-114.
Phillips, S. M., Barton, C. M., Lee, S. J., Morton, D. G., Wallace, D. M., Lemoine, N. R., and
Neoptolemos, J. P. (1994). Loss of the retinoblastoma susceptibility gene (RB1) is a frequent and early
event in prostatic tumorigenesis. Br J Cancer 70, 1252-1257.
Pollak, M. (2001). Insulin-like growth factors and prostate cancer. Epidemiol Rev 23, 59-66.
- 81 -
Polnaszek, N., Kwabi-Addo, B., Peterson, L. E., Ozen, M., Greenberg, N. M., Ortega, S., Basilico, C.,
and Ittmann, M. (2003). Fibroblast growth factor 2 promotes tumor progression in an autochthonous
mouse model of prostate cancer. Cancer Res 63, 5754-5760.
Reznikov, L. L., Puren, A. J., Fantuzzi, G., Muhl, H., Shapiro, L., Yoon, D. Y., Cutler, D. L., and
Dinarello, C. A. (1998). Spontaneous and inducible cytokine responses in healthy humans receiving a
single dose of IFN-alpha2b: increased production of interleukin-1 receptor antagonist and
suppression of IL-1-induced IL-8. J Interferon Cytokine Res 18, 897-903.
Robinson, E. J., Neal, D. E., and Collins, A. T. (1998). Basal cells are progenitors of luminal cells in
primary cultures of differentiating human prostatic epithelium. Prostate 37, 149-160.
Rohatiner, A. Z., Gregory, W. M., Peterson, B., Borden, E., Solal-Celigny, P., Hagenbeek, A., Fisher,
R. I., Unterhalt, M., Arranz, R., Chisesi, T., et al. (2005). Meta-analysis to evaluate the role of
interferon in follicular lymphoma. J Clin Oncol 23, 2215-2223.
Ropiquet, F., Giri, D., Kwabi-Addo, B., Mansukhani, A., and Ittmann, M. (2000). Increased expression
of fibroblast growth factor 6 in human prostatic intraepithelial neoplasia and prostate cancer. Cancer
Res 60, 4245-4250.
Rubin, M. A., Gerstein, A., Reid, K., Bostwick, D. G., Cheng, L., Parsons, R., and Papadopoulos, N.
(2000). 10q23.3 loss of heterozygosity is higher in lymph node-positive (pT2-3,N+) versus lymph
node-negative (pT2-3,N0) prostate cancer. Hum Pathol 31, 504-508.
Sato, K., Hida, S., Takayanagi, H., Yokochi, T., Kayagaki, N., Takeda, K., Yagita, H., Okumura, K.,
Tanaka, N., Taniguchi, T., and Ogasawara, K. (2001). Antiviral response by natural killer cells
through TRAIL gene induction by IFN-alpha/beta. Eur J Immunol 31, 3138-3146.
Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., and Wang, G. L. (1994). Transcriptional regulation of genes
encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem 269, 23757-23763.
Senger, D. R., Galli, S. J., Dvorak, A. M., Perruzzi, C. A., Harvey, V. S., and Dvorak, H. F. (1983).
Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science
219, 983-985.
Shand, R. L., and Gelmann, E. P. (2006). Molecular biology of prostate-cancer pathogenesis. Curr
Opin Urol 16, 123-131.
- 82 -
Shappell, S. B., Thomas, G. V., Roberts, R. L., Herbert, R., Ittmann, M. M., Rubin, M. A., Humphrey,
P. A., Sundberg, J. P., Rozengurt, N., Barrios, R., et al. (2004). Prostate pathology of genetically
engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of
the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res 64,
2270-2305.
Shi, Y., Brands, F. H., Chatterjee, S., Feng, A. C., Groshen, S., Schewe, J., Lieskovsky, G., and Cote, R.
J. (2001). Her-2/neu expression in prostate cancer: high level of expression associated with exposure
to hormone therapy and androgen independent disease. J Urol 166, 1514-1519.
Shimura, S., Yang, G., Ebara, S., Wheeler, T. M., Frolov, A., and Thompson, T. C. (2000). Reduced
infiltration of tumor-associated macrophages in human prostate cancer: association with cancer
progression. Cancer Res 60, 5857-5861.
Shinohara, N., Demura, T., Matsumura, K., Toyoda, K., Kashiwagi, A., Nagamori, S., Ohmuro, H.,
Ohzono, S., and Koyanagi, T. (1998). 5-fluorouracil and low-dose recombinant interferon-alpha-2a in
patients with hormone-refractory adenocarcinoma of the prostate. Prostate 35, 56-62.
Slaton, J. W., Perrotte, P., Inoue, K., Dinney, C. P., and Fidler, I. J. (1999). Interferon-alpha-mediated
down-regulation of angiogenesis-related genes and therapy of bladder cancer are dependent on
optimization of biological dose and schedule. Clin Cancer Res 5, 2726-2734.
Smith, J. R., Freije, D., Carpten, J. D., Gronberg, H., Xu, J., Isaacs, S. D., Brownstein, M. J., Bova, G. S.,
Guo, H., Bujnovszky, P., et al. (1996). Major susceptibility locus for prostate cancer on chromosome 1
suggested by a genome-wide search. Science 274, 1371-1374.
Stakleff, K. D., and Von Gruenigen, V. E. (2003). Rodent models for ovarian cancer research. Int J
Gynecol Cancer 13, 405-412.
Standop, J., Schneider, M. B., Ulrich, A., and Pour, P. M. (2001). Experimental animal models in
pancreatic carcinogenesis: lessons for human pancreatic cancer. Dig Dis 19, 24-31.
Stanford, J. L., and Ostrander, E. A. (2001). Familial prostate cancer. Epidemiol Rev 23, 19-23.
Sun, A., Tang, J., Hong, Y., Song, J., Terranova, P. F., Thrasher, J. B., Svojanovsky, S., Wang, H. G.,
and Li, B. (2008). Androgen receptor-dependent regulation of Bcl-xL expression: Implication in
prostate cancer progression. Prostate 68, 453-461.
- 83 -
Swann, J. B., Hayakawa, Y., Zerafa, N., Sheehan, K. C., Scott, B., Schreiber, R. D., Hertzog, P., and
Smyth, M. J. (2007). Type I IFN contributes to NK cell homeostasis, activation, and antitumor
function. J Immunol 178, 7540-7549.
Tanabe, T., Kominsky, S. L., Subramaniam, P. S., Johnson, H. M., and Torres, B. A. (2000). Inhibition
of the glioblastoma cell cycle by type I IFNs occurs at both the G1 and S phases and correlates with
the upregulation of p21(WAF1/CIP1). J Neurooncol 48, 225-232.
Thalasila, A., Poplin, E., Shih, J., Dvorzhinski, D., Capanna, T., Doyle-Lindrud, S., Beers, S., Goodin,
S., Rubin, E., and DiPaola, R. S. (2003). A phase I trial of weekly paclitaxel, 13- cis-retinoic acid, and
interferon alpha in patients with prostate cancer and other advanced malignancies. Cancer
Chemother Pharmacol 52, 119-124.
Thomlinson, R. H., and Gray, L. H. (1955). The histological structure of some human lung cancers
and the possible implications for radiotherapy. Br J Cancer 9, 539-549.
Tomita, K., van Bokhoven, A., van Leenders, G. J., Ruijter, E. T., Jansen, C. F., Bussemakers, M. J.,
and Schalken, J. A. (2000). Cadherin switching in human prostate cancer progression. Cancer Res 60,
3650-3654.
van Moorselaar, R. J., and Voest, E. E. (2002). Angiogenesis in prostate cancer: its role in disease
progression and possible therapeutic approaches. Mol Cell Endocrinol 197, 239-250.
Varambally, S., Dhanasekaran, S. M., Zhou, M., Barrette, T. R., Kumar-Sinha, C., Sanda, M. G.,
Ghosh, D., Pienta, K. J., Sewalt, R. G., Otte, A. P., et al. (2002). The polycomb group protein EZH2 is
involved in progression of prostate cancer. Nature 419, 624-629.
Verhage, B. A., and Kiemeney, L. A. (2003). Inherited predisposition to prostate cancer. Eur J
Epidemiol 18, 1027-1036.
Viacava, P., Naccarato, A. G., Bocci, G., Fanelli, G., Aretini, P., Lonobile, A., Evangelista, G.,
Montruccoli, G., and Bevilacqua, G. (2004). Angiogenesis and VEGF expression in pre-invasive
lesions of the human breast. J Pathol 204, 140-146.
von Marschall, Z., Scholz, A., Cramer, T., Schafer, G., Schirner, M., Oberg, K., Wiedenmann, B.,
Hocker, M., and Rosewicz, S. (2003). Effects of interferon alpha on vascular endothelial growth factor
gene transcription and tumor angiogenesis. J Natl Cancer Inst 95, 437-448.
- 84 -
Waltenberger, J., Claesson-Welsh, L., Siegbahn, A., Shibuya, M., and Heldin, C. H. (1994). Different
signal transduction properties of KDR and Flt1, two receptors for vascular endothelial growth factor.
J Biol Chem 269, 26988-26995.
Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., and Semenza, G. L. (1995). Hypoxia-inducible factor 1 is a basichelix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A 92,
5510-5514.
Webb, C. P., and Vande Woude, G. F. (2000). Genes that regulate metastasis and angiogenesis. J
Neurooncol 50, 71-87.
Weidner, N., Carroll, P. R., Flax, J., Blumenfeld, W., and Folkman, J. (1993). Tumor angiogenesis
correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. Am J Pathol 143, 401-409.
Weidner, N., Semple, J. P., Welch, W. R., and Folkman, J. (1991). Tumor angiogenesis and
metastasis--correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med 324, 1-8.
Wikstrom, P., Stattin, P., Franck-Lissbrant, I., Damber, J. E., and Bergh, A. (1998). Transforming
growth factor beta1 is associated with angiogenesis, metastasis, and poor clinical outcome in prostate
cancer. Prostate 37, 19-29.
Williams, R. H., Stapleton, A. M., Yang, G., Truong, L. D., Rogers, E., Timme, T. L., Wheeler, T. M.,
Scardino, P. T., and Thompson, T. C. (1996). Reduced levels of transforming growth factor beta
receptor type II in human prostate cancer: an immunohistochemical study. Clin Cancer Res 2, 635640.
Yancopoulos, G. D., Davis, S., Gale, N. W., Rudge, J. S., Wiegand, S. J., and Holash, J. (2000).
Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature 407, 242-248.
Yang, J., and Richmond, A. (2004). The angiostatic activity of interferon-inducible protein10/CXCL10 in human melanoma depends on binding to CXCR3 but not to glycosaminoglycan. Mol
Ther 9, 846-855.
Zhong, H., Agani, F., Baccala, A. A., Laughner, E., Rioseco-Camacho, N., Isaacs, W. B., Simons, J. W.,
and Semenza, G. L. (1998). Increased expression of hypoxia inducible factor-1alpha in rat and human
prostate cancer. Cancer Res 58, 5280-5284.
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PUBBLICAZIONI CONSEGUITE DURANTE IL PERIODO DI DOTTORATO
1. Favaro E., Nardo G., Persano L.,
L. Masiero M., Moserle L., Zamarchi Z., Rossi E.,
Esposito G., Plebani M., Sattler U., Mann T., Mueller-Klieser W., Ciminale V.,
Amadori A., Indraccolo S. Hypoxia inducible factor 1-alpha inactivation unveils
a link between tumor cell metabolism and hypoxia-induced cell death. Am J
Pathol. 2008 173(4):1186-201. Impact Factor: 5.487
2. Piovan E., Tosello V., Indraccolo S., Masiero M., Persano L.,
L. Esposito G.,
Zamarchi R., Ponzoni M., Chieco-Bianchi L., Dalla-Favera R., Amadori A.
Differential regulation of hypoxia-induced CXCR4 triggering during B cell
development and lymphomagenesis. Cancer Res., 2007, 67 (18): 8605-14. Impact
Factor: 7.672
3. Persano L.,
L. Crescenzi M., Indraccolo S. Anti-angiogenic gene therapy of cancer:
current status and future prospects. Mol Aspects Med, 2007, 28(1): 87-144.
Review Impact Factor: 7.386
4. Indraccolo S., Moserle L., Tisato V., Gola E., Minuzzo S., Roni V., Persano L.,
L.
Chieco-Bianchi L., Amadori A. Gene Therapy of ovarian cancer with IFN-alphaproducing fibroblasts: comparison of constitutive and inducible vectors. Gene
Ther, 2006, 13 (12): 953-65. Impact Factor: 4.812
5. Indraccolo S., Tisato V., Agata S., Moserle L., Ferrari S., Callegaro M., Persano L.,
L.
Palma M. D., Scaini M. C., Esposito G., et al. Establishment and characterization
of xenografts and cancer cell cultures derived from BRCA1 -/- epithelial ovarian
cancers. Eur J Cancer, 2006, 42 (10): 1475-83. Impact Factor: 4.454
6. Indraccolo S., Minuzzo S., Masiero M., Pusceddu I., Persano L.,
L Moserle L.,
Reboldi A., Favaro E., Mecarozzi M., Di Mario G., Screpanti I., Ponzoni M.,
Doglioni C., Amadori A. Crosstalk between tumor and enothelial cells involving
the Notch3-Dll4 interaction marks escape from tumor dormancy. In Press
7. Persano L.,
L Moserle M., Esposito G., Bronte V., Barbieri V., Iafrate M., Gardiman
M.P., Larghero P., Pfeffer U., Naschberger E., Stürzl M., Indraccolo S., Amadori
A. Interferon-α counteracts the angiogenic switch and reduces tumor cell
proliferation in a spontaneous model of prostatic cancer. Submitted
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Le persone che mi conoscono credo che sappiano che non sono mai stato
bravo a esprimere i miei sentimenti verso gli altri e quindi penso che non se la
prenderanno se spendo solo poche parole per ringraziarli.
Innanzitutto Lidia, instancabile compagna di lavoro, che ha condiviso con
me sin da subito le gioie e le delusioni di questo progetto e Gianni, al quale devo
tutto quello che so sul mondo dell’istologia.
Tutti i miei colleghi di laboratorio, vecchi e nuovi, che sanno bene cosa
vuol dire lavorare in quest’ambito e con i quali ho trascorso momenti
indimenticabili.
La mia fidanzata Marianna e i miei amici più cari: il vostro sostegno nei
momenti difficili è stato fondamentale.
Il Dott. Indraccolo e il Prof. Amadori per aver creduto in me e avermi
dato la possibilità di fare questa bellissima esperienza.
E infine tutte le persone che direttamente o indirettamente hanno
contribuito alla realizzazione di questo progetto.
A voi tutti un grazie di cuore
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