RADIOBIOLOGIA : BASI BIOLOGICHE ED APPLICAZIONI CLINICHE SC Radioterapia (dir. P. Gabriele) IRCC Candiolo (TO) La RADIOBIOLOGIA studia gli effetti delle radiazioni ionizzanti sui tessuti biologici Ricerca di base Applicazioni pratiche Ricerca teorica di base • studia gli effetti provocati dalle radiazioni • stabilisce una correlazione tra causa ed effetto • sviluppa modelli teorici di base previsionali Aspetti applicativi • per produrre effetti desiderati (radioterapia) • per evitare gli effetti indesiderati (radioprotezione) Sommario • • • • • • • • Fattori fisico-chimici di risposta biologica Funzioni cellulari Sistemi biologici Effetti dell’irradiazione Curve di sopravvivenza Frazionamenti e 4 R BED Applicazioni pratiche Interazione radiazioni - tessuti • Fase fisica: interazione tra fotoni ed elettroni orbitali degli atomi • Fase chimica: rapide reazioni chimiche cellulari immediatamente successive all’irradiazione • Fase biologica: tutti i processi relativi alle manifestazioni biologiche del danno Fase fisica e risposta biologica • modalità di interazione delle radiazioni con cellule (fase fisica : 10-16/ 10-12 s) • processi attivati (fase chimica : 10-12/ 10-1 s) • loro interazione per produrre un particolare effetto biologico (fase biologica : secondi/ore) le conseguenze cliniche possono manifestarsi da ore a mesi ad anni dopo l'irradiazione Le radiazioni sono un fenomeno di emissione e propagazione di energia nello spazio o in un mezzo materiale. radiazioni ionizzanti (energia > 2 eV) • Radiazioni elettromagnetiche (X, gamma) • Radiazioni corpuscolari (alfa, beta, neutroni) A radiazione corpuscolata B radiazione elettromagnetica c la radiazione attraversa l’atomo senza colpire nulla a la radiazione colpisce il nucleo b la radiazione colpisce un elettrone Fase fisica • Ionizzazione: espulsione di un elettrone da un atomo e creazione di una coppia di ioni • Eccitazione: spostamento di un elettrone ad un livello energetico superiore, con emissione fotonica secondaria e innesco di eventuali ionizzazioni a cascata Alla dose somministrata di 1 Gy, con radiazioni a basso LET, avvengono circa 105 ionizzazioni nel volume del diametro 10 micron Aspetti radiobiologici: grandezze • LET: trasferimento lineare di energia (quantità di energia depositata da una radiazione per unità di percorso nel materiale attraversato) • EBR: efficacia biologica relativa (rapporto tra la dose assorbita somministrata con un fascio di radiazioni di riferimento e la dose assorbita con radiazioni differenti per ottenere, a parità di altre condizioni, lo stesso effetto biologico) Effetto chimico primario L’instabilità degli atomi ionizzati ed eccitati accresce la reattività chimica dei medesimi, i quali tendono a modificare i rapporti con gli atomi e le molecole circostanti (scissione dei legami in atto o formazione di nuovi legami) • se la molecola interessata ha attività biologica, la sua modificazione strutturale può provocare una modificazione della sua attività biologica (fase biochimica). • in un sistema biologico, si ha sempre la presenza contemporanea di un elevato numero di molecole diverse (H20, acidi nucleici). • negli organismi superiori le molecole di rilevanza biologica sono il 20% della massa totale, mentre i 4/5 sono rappresentate da H20. • Per la distribuzione casuale delle ionizzazioni ne consegue che solo 1 interazione su 5 interesserà una molecola di rilevanza biologica, mentre 4 su 5 determineranno semplicemente modificazione delle molecole di H20 presenti nel sistema (il rendimento del sistema però è maggiore). Fase chimica – teoria del rendimento Le modificazioni delle strutture molecolari di importanza biologica avvengono in parte • DIRETTA (30%) • INDIRETTA mediata dalla radiolisi dell' acqua (70%) interazione indiretta interazione diretta fotone-DNA * H2O2 Effetto diretto • • • • interazione diretta con molecole “biologiche” * rottura legami nella catena nucleotidica del DNA Effetto indiretto interazione con le molecole di acqua presenti nella cellula produzioni radicali liberi (ROS) – fissazione radicali su molecole biologiche – induzione rottura legami chimici – induzione legami anomali – alterazione della struttura della molecola – alterazione della funzione legata alla molecola danneggiata * * * eaq O. OH . H2O Azione Indiretta - Radicali liberi hv + H2O H2O+ + e• Si definisce “radicale libero”ogni atomo o molecola che possiede un numero dispari di elettroni • Lo stato quantico dell’elettrone è definito anche dallo spin (spin bilanciato) • Se lo spin non è bilanciato, l’atomo tende a cedere un elettrone o ad assumerlo • H 2 O+ • H 2O + e- H+ + OH ° (idrogenione + radicale ossidrile) H 2 OH° + OH- (radicale libero idrogeno + ossidrile) H° + H° = H2 (stabile) H° + OH° = H2O (reazione di ritorno) OH° + OH°= H2O2 (stabile ad alto potere ossidante) Fenomeni di scavenging/fixation Nel primo millisecondo dall’irradiazione si instaura una “competizione” tra reazioni di fissazione del danno, fixation (la presenza di ossigeno è forse il più importante fattore sensibilizzante) e reazioni di annullamento dei radicali liberi, scavenging, mediate da composti con gruppi tiolici (-SH). Modalità di combinazione dei radicali liberi Modalità di combinazione dei radicali liberi Influenza della presenza di O2 O2 + H° = HO2 ° H° + HO2 ° = H2 O2 ( OER) La concentrazione di H2 O2 sarà tanto più rilevante quanto minore sarà la formazione dei radicali liberi e cioè quanto minore sarà la probabilità di combinazione tra loro dei radicali OH ° . Poiché ciò dipende dalla distanza relativa tra loro dei radicali H ° e OH °, l’influenza dell’ossigeno è più rilevante per radiazioni scarsamente ionizzanti. È da attendersi una minore efficacia dell’ossigeno a parità di concentrazione quando aumenta la concentrazione dei radicali liberi. Modalità di combinazione dei radicali liberi con altre molecole I gruppi tiolici (SH) possono essere ossidati dai OH° e dar luogo a ponti disolfuri -SH OH° + -SH -S = OH° +2 H 2O -S RH + OH° = R° + H 2O (radicale libero organico) R°+ OH° = ROH (formazione alcolica) R°+ R° = R R (formazione di un ponte intra o intermolecolare) R°+ O2 = R O2 ° (radicale perossidato) R O2 ° + RH = ROOH + R° (gruppo carbossilico e nuovo R°) danno di una base (mutazione) __ C__G __ ___A___ T___ danno di uno zucchero legame crociato con una proteina _______ legame crociato tra singoli filamenti (impedita la duplicazione delle due catene) rottura della doppia elica (DSB) rottura di un singolo filamento Sommario • • • • • • • • Fattori fisico-chimici di risposta biologica Funzioni cellulari Sistemi biologici Effetti dell’irradiazione Curve di sopravvivenza Frazionamenti e 4 R BED Applicazioni pratiche Funzioni cellulari • Funzione vitale: alcune strutture esplicano attività indispensabile per la vita e se danneggiate determinano la morte cellulare • Funzioni accessorie: motorie, di sintesi, di trasferimento che richiedono la presenza di molecole complesse • Funzione proliferativa: funzione direttamente collegata con la trasmissione e conservazione dell’informazione ereditaria. Le alterazioni di questa funzione possono tradursi nella morte riproduttiva Ciclo cellulare Ogni cellula per dividersi passa attraverso 4 fasi G1 Sintesi del DNA G2 Mitosi riciclo o passaggio in quiescenza (G0) Check points = fasi di arresto della progressione del ciclo con funzione di controllo della integrità cellulare Reclutamento = trasferimento dalla fase di quiescenza alla fase di proliferazione SUSCETTIBILITA' DEL DNA AL DANNO RADIOINDOTTO L' associazione del DNA con le proteine a formare la cromatina "scherma" una cospicua porzione di doppia elica il danno è più probabile quando il DNA non è organizzato in cromatina : durante la trascrizione di un gene (fase G2) durante la mitosi (fase M) all' inizio della fase S del ciclo cellulare L' iperploidia rende le cellule meno radiosensibili ( la perdita di geni "critici" viene sopperita dall' attivazione di copie degli stessi ) suscettibilità al danno radioindotto in funzione della fase del ciclo cellulare late-S frazione sopravvivente early-G1 M -G2 early-S dose DNA damage • L’irradiazione a dosi terapeutiche provoca danni di entità notevole al DNA, la maggior parte dei quali viene riparata con successo da processi cellulari specifici (polimerasi) • Evidenze sperimentali indicano che la quota di cell-killing è legata sostanzialmente al numero delle Double Strand Breaks radioindotte, che sono considerate le lesioni critiche 1 la lesione viene riparata 2 la lesione non è riparabile morte della cellula o della sua progenie 3 la lesione è potenzialmente riparabile, ma viene convertita in irreparabile (damage "fixed" in place) morte cellulare 4 la lesione viene riparata, ma la riparazione non è accurata inconseguente mutazione cancerogena letale DANNO DI TIPO MITOTICO • La morte mitotica avviene quando la cellula che ha subito un danno non riparabile del DNA si divide (alla prima divisione o dopo alcune divisioni) • La morte mitotica è tanto più più probabile quanto maggiore è la frequenza con cui le cellule clonogeniche si dividono e quanto maggiore è la frazione di cellule in attività mitotica • La dinamica temporale con cui un tessuto organizzato manifesta il danno mitotico delle cellule che lo compongono dipende dalla organizzazione del ricambio tessutale di tale tx Morte “mitotica” : l’entità del danno cromosomale condiziona i processi di divisione cellulare; mitosi aberranti conducono a errori di distribuzione dei cromosomi e perdita di frammenti: questi eventi conducono alla morte delle cellule dopo 1 o più mitosi MORTE CELLULARE RADIOINDOTTA: (2)morte in interfase Alcuni tipi cellulari muoiono, senza attraversare la fase mitotica, in fase G0-G1, dopo dosi relativamente basse di radiazioni, per apoptosi (linfociti, cellule germinali, epiteliali, neoplasie della serie linfoide) Morte “in interfase” – morte apoptotica: le cellule vanno incontro a degenerazione e apoptosi prima di dividersi; geneticamente mediata, è tipica dei linfociti normali e delle cellule leucemiche. Ha caratteristiche morfologiche distinte dalla necrosi APOPTOSI • L' apoptosi è un processo attivo di morte cellulare che risulta dall' attivazione di un programma genetico. • E' un processo fisiologico utilizzato dall' organismo durante lo sviluppo embrionale e fetale, e nei tessuti maturi per mantenere l'omeostasi (controllo delle dimensioni delle popolazioni di cellule normali). • Può essere indotta, oltre che dalle radiazioni, anche da alcuni agenti chemioterapici, ipertermia, stress ossidativo, sospensione di ormoni o fattori di crescita. APOPTOSI Gli elementi chiave nel processo di apoptosi sono prodotti di oncogeni e di geni oncosoppressori una loro mutazione, o una loro anormale espressione, può promuovere l' insorgenza di un tumore. • Una aumentata espressione di bcl-2, o una inattivazione di p53, possono promuovere la progressione tumorale sopprimendo l'apoptosi. • Una alterazione di questi stessi geni può altresì alterare negativamente la radiosensibilità intrinseca delle cellule. APOPTOSI • Sono stati identificati diversi geni regolatori dell' apoptosi: - PROMOTORI: eg, p53, IRF-1, bax, c-myc - SOPPRESSORI: bcl- 2 • Il bilancio tra fattori pro- ed anti-apoptotici è determinato dal tipo di segnali trasdotti dall' ambiente extracellulare e dal programma interno della cellula. Apoptosis main signal transducer : p53 Cell cycle arrest Differentiation p53 Senescence DNA repair Apoptosis APOPTOSI E RADIOTERAPIA • Tumori animali contenenti molte cellule spontaneamente apoptotiche mostrano un elevato indice apoptotico dopo l'irradiazione e sono relativamente radiosensibili. • Tumori umani di tipi istologici che tendono a mostrare maggiore apoptosi spontanea sono più facilmente controllabili da radio- e chemioterapia. implicazioni terapeutiche ancora da valutare ... … A LIVELLO MOLECOLARE Eventi del danno radiobiologico regolati da mediatori espressi da geni attivati dalla esposizione alle radiazioni • Induzione morte apoptica • Induzione mediatori della flogosi (reazione acuta) • Induzione danno endoteliale (necrosi tardiva) • Induzione produzione collageno (fibrosi tardiva) • Arresto progressione ciclo (riparazione DNA) • Induzione proliferazione (ripopolazione) • Variazione microambiente < produzione ROS (radioresistenza) Sommario • • • • • • • • Fattori fisico-chimici di risposta biologica Funzioni cellulari Sistemi biologici Effetti dell’irradiazione Curve di sopravvivenza Frazionamenti e 4 R BED Applicazioni pratiche