Metodologie di embriologia sperimentale
Luca Del Giacco
[email protected]
http://users.unimi.it/delgi/
sezione Functional and Reproductive Biology
Torre B, piano 7
biologia dello sviluppo
La biologia dello sviluppo studia tutti i processi che riguardano lo sviluppo, a
partire dalla cellula uovo fecondata fino alla nascita ed oltre.
differenziamento
Dal singolo uovo fecondato (lo zigote unicellulare) si origina un n° enorme di
diversi tipi cellulari con le più disparate funzioni. Tutte queste cellule (a parte
poche eccezioni) contengono il medesimo patrimonio genetico.
morfogenesi
Le cellule che man mano si differenziano si organizzano in tessuti ed organi
piuttosto che essere distribuite in modo più o meno casuale.
accrescimento
Le cellule che si stanno dividendo hanno perfettamente presente quando
smettere di farlo. La divisione cellulare è strettamente regolata.
riproduzione
L’uovo e lo spermatozoo sono quelle cellule ad alta specializzazione che
garantiscono la trasmissione alla generazione successiva delle informazioni
per costruire un nuovo organismo.
biologia dello sviluppo
embriologia
sperimentale
biologia
dello
sviluppo
biologia
molecolare
genetica
dello
sviluppo
embriologia sperimentale
Programmi di ricerca dell’embriologia sperimentale:
1.Come l’ambiente (le ‘forze esterne’) influenza lo sviluppo dell’embrione
2.Come le ‘forze interne’ all’embrione determinano il differenziamento delle
cellule
3.Come le cellule si organizzano in tessuti ed organi
integrazione ambientale
L’ambiente influenza lo sviluppo
Alcohol
integrazione ambientale
1.Come l’ambiente influenza lo sviluppo dell’embrione: determinazione del
sesso nel verme echiuroideo Bonellia viridis
integrazione ambientale
1.Come l’ambiente influenza lo sviluppo dell’embrione: determinazione del
sesso nel verme echiuroideo Bonellia viridis
integrazione ambientale
L’aromatasi è prodotta sia dalle gonadi che dal cervello dell’embrione. La
attività aromatasica nelle gonadi rimane costante, mentre nel cervello
cambia drasticamente aumentando di molto a temperature ‘femminilizzanti’
embriologia sperimentale
Nei rettili la determinazione primaria del sesso è ormone-dipendente. Gli
estrogeni, essenziali per lo sviluppo dell ’ ovario, sono in grado di
determinare lo sviluppo di femmine anche a temperature mascolinizzanti.
Viceversa, uova trattate con inibitori della sintesi degli estrogeni danno alta
percentuale di maschi anche se incubate a temperature ‘femminili’.
La ‘link’ tra sesso, estrogeni e temperatura è l’enzima aromatasi, che
converte il testosterone in estrogeni
genetica dello sviluppo
Il controllo esercitato dai geni sullo sviluppo dell’embrione. La genetica dello
sviluppo ha nello studio dei mutanti il suo punto di forza. I notevoli passi
avanti nel campo hanno messo in evidenza come i geni che controllano le fasi
precoci dello sviluppo embrionale siano evolutivamente conservati
genetica dello sviluppo
mutante eyeless
twin of eyeless
Small eye (Pax6)
Aniridia
genetica dello sviluppo
mutanti dello sviluppo
- mutazioni spontanee
- mutazioni indotte:
- mutageni chimici (mutazioni puntiformi)
- radiazioni (delezioni)
mutazioni recessive
- perdita di funzione (solitamente recessiva se non
sussiste aploinsufficienza, altrimenti dominante)
mutazioni dominanti:
- guadagno di funzione
- dominante negativa
genetica dello sviluppo
genetica dello sviluppo
N -ethyl- N -nitrosourea (ENU)
mutanti
SLC24A5, uno scambiatore di cationi, influenza la pigmentazione in zf e uomo
embriologia sperimentale
L’embriologia sperimentale studia i meccanismi alla base dei processi
ontogenetici turbandone il naturale corso mediante manipolazione degli
embrioni
• Cutting
• Pasting
• Painting
embriologia sperimentale
microiniezione
microiniezione
overespressione genica (pasting)
overespressione genica (pasting)
Agouti-related
peptide
(AgRP),
un
neuropeptide
prodotto
nel
nucleo arcuato dell’ipotalamo, aumenta l’appetito e diminuisce il
metabolismo.
pasting*
knock-DOWN genico (cutting)
•Antisense oligonucleotides
•Designed as 25 mers
•Resistant to digestion
•Not RNAseH mediated
knock-DOWN genico (cutting)
•Antisense oligonucleotides
•Designed as 25 mers
•Resistant to digestion
•Not RNAseH mediated
MO mimano mutazioni
painting
embrioni “chimera”: le cellule di donatore e ricevente sono geneticamente (quindi
fenotipicamente) differenti. Trapianto di cellule di quaglia in embrione di pollo.
painting
thymidine kinase
topo knock-out
Differenziamento (espressione genica differenziale)
Dal singolo uovo fecondato (lo zigote unicellulare) si origina un n° enorme di
diversi tipi cellulari con le più disparate funzioni.
1.tutte le cellule di un organismo (a parte poche eccezioni) contengono il
medesimo patrimonio genetico.
2.i geni non utilizzati vengono comunque conservati e possono sempre venire
espressi.
3.ogni cellula esprime solo una piccola percentuale del genoma (es.
cromosomi politenici di Drosophila).
espressione differenziale
Cromosomi politenici.
biologia molecolare
La biologia molecolare studia i processi biologici a livello dei meccanismi
molecolari.
tecniche di biol molec
tecniche di biol molec
tecniche di biol molec
tecniche di biol molec
9dd
10dd
15dd
Ibridazione in situ con al sonda antisenso per Pax6 che mostra l’espressione del gene
nell’occhio di topo in sviluppo. Pax6 è espresso sia nell’ectoderma del cristallino presuntivo
che nel peduncolo ottico che formerà retina e nervo ottico.
tecniche di biol molec