TeCoRe
Insegnamento
CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE
Docente
Prof. Daniele Fabbri
Laboratori di Scienze Ambientali via S.Alberto, 163
[email protected] Tel. 0544 - 937344
Materiale didattico
Rubinson and Rubinson, Chimica Analitica Strumentale, 2002.
Fifield and Kealey, Chimica Analitica, teoria e pratica, 1999.
Lucidi: disponibili on-line o presso portineria sede.
PROGRAMMA
PARTE PRIMA.
Fasi di un procedimento analitico Valutazione del metodo analitico.
Campionamento e preparazione del campione
Analisi quantitativa
PARTE SECONDA
Spettrometria atomica: FAAS GFAAS, HGAAS,ICP-AES, ICP-MS.
LABORATORI
strumenti di indagine bibliografica - uso banche dati
Analisi metalli assorbimento atomico. Calibrazione esterna.
Analisi acidi grassi gas cromatografia. Calibrazione interna.
Elaborazione dati (EXCELL)
ESAME
Orale.
Discussione esercitazione in biblioteca (articolo scientifico ottenuto
da una ricerca bibliografica).
Discussione esercitazioni di laboratorio (relazioni).
Domande sul programma.
lot
CAMPIONE
materiale
per
il
quale
un’informazione analitica
è
richiesta
campione: porzione di materiale
selezionato per rappresentare un
corpo più esteso di materiale.
sub-sample:
porzione
del
campione ottenuto per suddivisione
o selezione.
campione
del
campione
test:
laboratorio:
materiale inviato al laboratorio per
le analisi
campione
preparato partendo dal campione di
laboratorio
test portion: il materiale pesato e
sottoposto all’analisi.
soluzione di misura
PREPARAZIONE
DEL CAMPIONE
TRATTAMENTO
DEL CAMPIONE
Il campione deve essere:
 RAPPRESENTATIVO: la composizione è, nella sua globalità,
identica a quella del materiale di partenza.
 OMOGENEO: la composizione è la medesima in tutte le sue
parti.
INTEGRO: non ci devono essere alterazioni durante il trasporto,
la conservazione ….(adsorbimento, volatilizzazione, …)
altrimenti non si può mettere in relazione il risultato finale con il
materiale originale, non importa quanto accurata sia l’analisi
ANALITA il componente da misurare attraverso l’analisi del campione
Specificare l’identità dell’analita.
nome comune
nome commerciale
nome IUPAC
Chemical Abstract Registry Number (CA RN)
formula di struttura
nome della miscela, presenza di isomeri, sottoprodotti…?
esempio :
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
struttura molecolare
DDT
p,p’-DDT
diclorodifeniltricloroetano
1,1,1-tricloro-2,2-bis(4-clorofenil)etano (IUPAC)
1,1’-(2,2,2-tricloroetilidene)bis[4-clorobenzene]
(CA)
CA RN 50-29-3
Trade Names: Agritan, Anofex, Arkotine, ….,Santobane,
Zeidane, Zerdane…
Vedi :esercitazione in biblioteca
MATRICE i componenti del campione chimicamente diversi dall’analita.
Il termine MATRICE è usato anche per Indicare le caratteristiche fisiche del
campione (solido, liquido, gassoso, organico, inorganico, ecc). La natura della
matrice e dell’analita definiscono la procedura di preparazione e trattamento del
campione. Esempio:
 ANALITA
MATRICE
TRATTAMENTO
inorganico
inorganica
dissoluzione-digestione
 inorganico
organica
distruzione sostanza organica
 organico
inorganica
estrazione
 organico
organica
estrazione selettiva
Analysts are seldom lucky enough to be able to inject samples with no pretreatment RE Majors, LC-GC 2003
INTERFERENZA effetto indesiderato di un componente sulla
accuratezza della misura di un altro componente.
Esempi:
Interferenza da PAN nella determinazione NOx nell’atmosfera.
[NOx] = [NO] + [NO2] ; PAN = perossiacetilnitrato
Si effettua misura NO per chemiluminescenza, dopo che un convertitore ha
trasformato NO2 in NO. Il convertitore trasforma anche il PAN in NO. Interferenza
trascurabile nelle zone urbane ([NOx] >> [PAN]), significativa nelle zone rurali
([NOx]max).
Interferenza dei cloruri nella determinazione ICP-MS dell’arsenico.
Il cloruro produce nel plasma lo ione 40Ar35Cl+ isobaro con 75As+ .
CONTAMINAZIONE
introduzione non intenzionale dell’analita o di altre specie nel campione
possibile causa di errore nella determinazione.
Spesso è irriproducibile ed erratica.
Esempio: lavaggio della vetreria inadeguato per l’analisi di metalli in
tracce.
GLI ERRORI
ng / l
La storia contaminata.
Concentrazioni di piombo nell’acqua di
mare pubblicate dal 1938 al 1980.
tratta da M.Stoeppler Ed. Sampling and
Sample Prep., Springer 1997
10000
1000
100
10
anno
1
1930
1940
1950
1960
1970
1980
Errori casuali :
originati da processi incontrollabili e indeterminati, riducibili
(ma non eliminabili) con un lavoro attento, presentano
variazioni positive e negative, misurati dalla deviazione
standard s.
Minore il contributo degli errori casuali, più precisa la
procedura.
Errori sistematici (determinati):
originati da cause determinate con lo stesso andamento
(positivo o negativo), in principio eliminabili. Misurati dal
bias.
Errori grossolani.
Errori di calcolo, lettura, ….
RISULTATO il valore finale riportato per una quantità misurata o calcolata
dopo avere effettuato la procedura di misurazione comprese le opportune
valutazioni.
numero + unità di misura + incertezza
ESEMPIO:
valore medio Xm ± deviazione standard s , n (numero di misure)
stima del valore ± stima della “precisione”, n
Cifre significative:
Le cifre note con certezza più la prima cifra incerta (qualunque sia la
posizione della virgola).l
L’errore di una misura è rappresentato dall’errore sull’ultima cifra.
Gli zeri a destra delle cifre significative sono significativi (se dopo la
virgola), a sinistra no (indicano l’ordine di grandezza).
0.0410 tre cifre significative
650
tre o due cifre significative, meglio usare la notazione scientifica:
6.50·102 oppure 6.5·102
LA PROCEDURA ANALITICA
definizione
dell’informazione
desiderata
scelta del metodo
strategia di campionamento
campionamento
omogeneizzazione
conservazione …
pretrattamento:
eliminazione interferenti
forma idonea per l’analisi
convertire i dati in
risultati numerici
interpretazione dei
risultati
ricerca bibliografica
determinazione
-bianco
- calibrazione
- campione
- RM, CRM
subsampling
campione per il laboratorio
aliquote per le analisi
CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE
volatilizzazione
fotodegradazione
attività
microbica
rilascio di
contaminanti
reazioni
chimiche
adsorbimento
ossidazione
TRATTAMENTO DEL CAMPIONE
 Trasformare analita/matrice nella forma più adatta alla tecnica d’analisi
 Rimuovere interferenti
 Ottenere concentrazione ottimale
Evitare contaminazione.
Minimizzare perdite
Durante il trattamento del campione si possono avere perdite di analita. La capacità
della procedura analitica di misurare la quantità reale di analita presente
inizialmente nel campione è espressa dal recupero (recovery):
R, recupero % = Cmisurata/Cattesa·100 = Qmisurata/Qattesa·100
La concentrazione C (o quantità Q) di analita attesa può essere ottenuta dal valore
certificato di un CRM, oppure stabilita preparando un campione fortificato.
Il valore ideale è R = 100%
Se R < 100% possibili cause: perdite durante le fasi di trattamento (filtrazione, ecc.)
Se R > 100% possibili cause: contaminazione.
Esempi di trattamento del campione
METALLI
Matrice : acqua
 Filtrazione.
preconcentrazione: complessare il metallo con un legante organico per
estrarlo in un solvente organico.
Matrice: solida
 digestione: trattamento con acidi forti concentrati a caldo; bomba per
digestione se si formano prodotti volatili; digestione assistita da microonde
(T< 200°C)
Acidi utilizzati:
HNO3, H2SO4, HClO4: ossidanti, precauzioni se organici elevato.
HCl: complessante, in miscela con altri acidi.
HF: disgregazione totale silicati; per analisi concentrazione totale.
ORGANICI
 estrazione. (biota dopo saponificazione; sedimenti); a riflusso; soxhlet;
estrazione accelerata con solvente (ASE T>, P>, t<, V<); con fluidi
supercritici (SFE; es.CO2).
 cromatografia su colonna; per eliminare interferenti.
criteri per la scelta del metodo analitico
FIGURE DI MERITO
costi/investimenti
precisione
durata dell’analisi
throughput
accuratezza (bias)
sensibilità
sicurezza, tossicità reagenti
greenness
limite di rivelabilità
abilità richiesta all’operatore
selettività
portability
intervallo dinamico
ruggdness
dimensione del campione
VALIDAZIONE è il processo che permette di dimostrare se i risultati ottenuti
con il metodo sono affidabili, riproducibili e se il metodo è adatto per
l’applicazione richiesta.
Può essere effettuata tramite:
 Confronto con un metodo differente sullo stesso campione (le fonti di errori
dovrebbero essere differenti).
Confronto con altri laboratori (partecipazione a studi inter-laboratorio).
Uso di materiali di riferimento (certificati).
Quando validare un metodo
 Viene sviluppato un nuovo metodo per risolvere un particolare problema.
 Si intende migliorare un metodo esistente per estenderlo ad un nuovo problema.
 Il controllo di qualita’ mostra che le prestazioni del metodo stanno cambiando.
Si intende valutare la prestazione del laboratorio anche per un metodo esistente,
utilizzato da un altro laboratorio, analista, …
materiali di riferimento - materiali di riferimento certificati (CRM)
Reference material (RM): a material or substance, one or more of whose property
values are sufficiently homogeneous and well-established to be used for the
calibration of an apparatus, for the assessment of a measurement method or for
assessing values to materials.
Certified reference material (CRM): a reference material, accompained by a
certificate, one or more of whose property values are certified by a procedure. This
procedure enables the material’s traceability to be established in terms of the SI
unit (to be understood as: a mole of a substance…). Each certified value is
accompanied by an uncertainty at a stated level of confidence. ISO guide 1991
Alcuni enti che producono (C)RM
ASTM American Society for Testing and Materials
BCR
Bureau Communitaire de Reference
IAEA
International Atomic Energy Agency
NIST
National Institute of Standard and Technology
NRC
National Research Council of Canada
Come scegliere i crm
Il materiale di riferimento dovrebbe avere una composizione simile a quella del
campione (matrix matching)
Contenere l’analita ad una concentrazione simile a quella del campione.
PRECISIONE
concordanza fra misure ripetute
analisi
strumentale
soluzione
di misura
valori misurati
X1
X2
X3
X4
Serie: i risultati …Xi… di analisi ripetute usando un solo metodo analitico
su un materiale omogeneo
n : il numero totale dei valori misurati della serie. Il numero di repliche n
va sempre riportato.
Media (aritmetica) :
Xm = SXi / n = (X1 + X2 + X3 + X4) / n
indici della precisione (imprecisione) della misura
Stima della deviazione standard: s = [S(Xi - Xm)2/ (n -1)]1/2
Deviazione standard relativa: sr = s / Xm
errore standard della media: s/n1/2
numero minimo consigliato per una stima utile: n = 6
Esempi di analisi replicate
misura
calcoli
valore
misurato
X1
campione
test
prelievo
porzione test
trattamento
soluzione
di misura
X2
X3
X4
prelievo
porzioni test
campione
test
trattamento
soluzione
di misura
misura
calcoli
valore
misurato
X1
X2
X3
X4
Precisione del metodo
Y1 = 10.09
Y2 = 10.11
Calcoli:
Ym = 10.102
s = 0.0130
rsd% = 0.13 %
Y3 = 10.09
Y4 = 10.10
Risultato:
Ym = 10.10 ± 0.013
n=5
Y5 = 10.12
digestione
20 mL
0.5344 g
diluizione
2 mL a 10 mL
misura
conc. rame
nella soluzione
0.383 mg/L
20 mL
0.377 mg/L
0.4984 g
20 mL
0.5003 g
0.394 mg/L
20 mL
0.380 mg/L
0.5034 g
Risultato:
75.4 ug /g ± 2.9 ug/g
(RSD = 3.8 %) n = 4
oppure 75 ug /g ± 3 ug/g n = 4
Ripetibilità : s è riferito allo stesso metodo sullo
stesso materiale nelle stesse condizioni
(operatore, apparato, laboratorio) dopo brevi
intervalli di tempo.
Riproducibilità : s è riferito allo stesso metodo
sullo stesso materiale in condizioni diverse
(operatore, apparato, laboratorio) e/o dopo
lunghi intervalli di tempo.
tempo
Currie and Svehla, Pure and Appl.Chem. 66(1994)595.
Valore vero t : valore ideale che si potrebbe ottenere se tutte le
cause di errore fossero eliminate e l’intera popolazione fosse
campionata.
Valore ‘ritenuto vero’ T (accepted reference value; conventional true
value) valore attribuito ad una quantità e accettato con un
incertezza appropriata per un determinato scopo.).
CRM
T è il valore certificato
materiale FORTIFICATO (spiked)
T è il valore stabilito dall’aggiunta
dell’analita
ACCURATEZZA (accuracy):
concordanza tra il risultato ed il valore ‘vero’ T
L’accuratezza è un concetto qualitativo. Una misura è
accurata quando è precisa e libera da bias.
ESATTEZZA (trueness): vicinanza di accordo tra il valore
medio Xm ottenuto da una serie grande di misure e T.
ACCURATEZZA
PRECISIONE
ESATTEZZA
diminuita da
errori casuali
diminuita da
errori sistematici
Errore del risultato :
Ei = Xi - T
Errore relativo:
Er = E / T
Errore relativo percentuale Er(%) = E/T•100
BIAS
E = Xm - T
Ei = (Xi - Xm) + (Xm -T) = Ecasuale + Esistematico(bias)
In questo caso l’accuratezza indica una combinazione di errori
casuali e sistematici.
Currie and Svehla, Pure and Appl.Chem. 66(1994)595.
bias totale
bias del lab
valore misurato
media laboratorio
bias del
metodo
media
inter-laboratorio
valore vero
Bias del metodo: tipico del metodo, l’errore si presenta in
qualsiasi laboratorio; corrisponde al bias di un test interlaboratorio.
Bias del laboratorio: comprende il bias del metodo e il
bias inerente al dato laboratorio.
CALIBRAZIONE insieme di operazioni che stabiliscono, sotto condizioni
specificate, le relazioni tra i valori delle quantità indicate da un sistema di misura e i
valori corrispondenti realizzati da uno standard.
STANDARD di
CALIBRAZIONE
Qst
materiale con valori noti
della quantità Qst da
misurare.
Esempio: composto puro in un
solvente.
STRUMENTO DI
MISURA
segnale
Yst
CONFRONTO. Calibration is comparison
RELAZIONE Q - Y
CAMPIONE
segnale
Yc
STRUMENTO DI
MISURA
Qc
Nota bene:
non confondere CALIBRAZIONE (= relazione tra segnale e misurando) e
TARATURA (= accertamento funzionalità di uno strumento).
PROTOCOLLO DI CALIBRAZIONE
preparazione
(ottenimento) degli
standard
analisi dei
campioni
analisi degli
standard
produrre il modello di
calibrazione
applicare il modello di
calibrazione ai dati dei
campioni
Y = aX + b
ricalibrare
regolarmente
Il modello di calibrazione viene utilizzato per ricavare il valore di C del campione utilizzando
la funzione inversa: MODELLO ANALITICO.
X=Y-b/a
stock
solution
diluizioni seriali
1000 mg Cu / L
1 mL qb a 200 mL
1 mL qb a 100 mL
PROTOCOLLO DI
CALIBRAZIONE
50.0 ugCu / L
0 uL
+
solvente
1000 uL
soluzioni di
calibrazione
bianco
misura
modello di
calibrazione
segnale
Y
0.002
Y = 0.0158*C + 0.0045
R2 = 0.9981
1
100 uL
+
900 uL
5.00 ug/L
0.092
0.75
250 uL
+
750 uL
12.5 ug/L
0.202
0.5
500 uL
+
500 uL
25.0 ug/L
0.378
0.25
750 uL
+
250 uL
37.5 ug/L
0.615
1000 uL
+
0 uL
50.0 ug/L
0.788
Y
ug / L
0
0
10
20
30
40
50
ANALISI CAMPIONE
segnale
campione
test
prelievo
porzione test
trattamento
soluzione
di misura
0.513
modello di calibrazione
modello analitico
C = (Y - 0.0045) / 0.0158
Y = 0.0158*C + 0.0045
1
Y
0.75
0.513
0.5
0.25
ug / L
0
0
10
misura
20
30
40
32.2 ug/L
50
la curva di calibrazione
Y
Yb
intervallo dinamico lineare
LOD LOQ
LOL
concentrazione C
A valori bassi di concentrazione il segnale è troppo debole;
A valori alti di concentrazione si hanno deviazioni dalla
proporzionalità (a in genere diminuisce all’aumentare di C).
INTERVALLO DINAMICO (dynamic range) del metodo: valori estremi di
concentrazione C fra cui si registra una variazione netta del segnale Y al
variare di C.
INTERVALLO DINAMICO LINEARE: valori di estremi di concentrazione
(LOQ-LOL) in cui il segnale Y varia linearmente con la C.
REGRESSIONE LINEARE :
l’operazione per ottenere la relazione lineare Yr = b + a•Cr che meglio
interpola i dati sperimentali
Yst, Xst ottenuti dall’analisi di N soluzioni di calibrazione.
La retta ottimale è quella che minimiza la somma dei quadrati
dei residui :
S(Yst - Yr)2  valore minimo
Y
Yr = a•Xr + b
PENDENZA (sensibilità)
a = S(Xst - Xm)•(Yst - Ym)/S(Xst-Xm)2
INTERCETTA
b = Xm - a•Xm
Yst, Xst
X
Ym = SYst / N
Cm = SCst / N
Xm, Ym centroide
il modello di calibrazione
single-point calibration :
La calibrazione più semplice è quella in cui si usa un solo standard): Yst, Xst.
Si assume Y = 0 per X = 0; risposta lineare da X = 0 a X = Xst (estrapolazione oltre i valori
Yst, Xst sconsigliata).
Modello di calibrazione lineare
:
Y = a•C + b = S•C + Yb
I chimici hanno favorito metodi con relazioni lineari, causa difficoltà ad interpolare curve. Ci
sono metodi analitici non-lineari (saggi immunologici).
Con lo sviluppo dei computer l’interpolazione dei punti diventa più semplice.
Difficile trovare equazioni su basi teoriche teoriche, perché la non-linearità è dovuta a molteplici
cause. Relazioni empiriche:
Modello di calibrazione polinomiale :
Y = b + a•C + a’•C2 + a’’•C3 + …
problemi: necessita più standard, maggiori difficoltà nella valutazione
dell’incertezza,
SENSIBILITÀ costante di propozionalità tra il segnale ed il misurando
.S = dY / dX
pendenza della retta di calibrazione Y = a C + b
Y
metodo più sensibile
metodo meno sensibile
C
è una misura dell’abilità di un metodo di distiguere piccole differenze di
concentrazioni dell’analita.
esempio
assorbanza
252.85
252.41
251.92
251.61
251.43
250.69
intensità relativa
Analisi del Si tramite AAS
251.61
251.92
lunghezza d’onda, nm
concentrazione Si, mg/L
linee analitiche del Si
nell’intervallo 250-253 nm
curve di calibrazione lineari
per ogni linea analitica.
La sensibilità dipende dalla scelta della l di misura
CALIBRAZIONE ESTERNA
standard esterno analita nella soluzione di calbrazione misurato
separatamente dal campione.
Il campione contenente quantità ignote di analita e le soluzioni di
calibrazione contenenti quantità note di analita standard sono
separate.
Soluzioni di calibrazione preparate per diluizioni seriali da una soluzione
madre concentrata.
Composizione soluzione di calibrazione simile alla soluzione del
campione ?  matrix matching
Soluzioni del bianco.
Es. solvente puro (es. H2O), azzeramento dello strumento.
Soluzione del bianco procedurale (dei reagenti): contiene tutte le
sostanze usate nella preparazione del campione alla stessa
concentrazione della soluzione di misura (il valore va sottratto da
quello del campione). (es. soluzioni di HNO3/HCl)
Matrix blank solution: contiene anche i costituenti della matrice (es.
sedimento).
CALIBRAZIONE INTERNA
standard interno sostanza differente ma simile all’analita
(surrogato: comportamento simile a quello dell’analita).
può essere aggiunto al campione nella fase iniziale della
procedura, in fasi successive o nella soluzione di misura.
Scopo: controllare un passaggio critico causa di elevata
incertezza.
Rapporto [analita]/[surrogato] meglio di [analita] solo
Fattore di risposta
F = [analita]•Ys/[surrogato]•Ya
Esempi surrogato:
Cd per Tl,
Pd per Pt spettroscopia atomica
57Co (radioattivo) per 59Co analisi radiochimica
composto organico marcato con 2H, 13C analisi MS
appartenente alla stessa classe (CH3(CH2)17COOH per acidi
grassi)
standardizzazione interna
Preparazione delle soluzioni di calibrazione. Lo standard interno si trova
alla stessa concentrazione in tutte le soluzioni (e lo sarà nella soluzione
campione), mentre la concentrazione dell’analita varia.
soluzione di standard interno
soluzione di analita
solvente
area analita / area s.i.
concentrazione analita
Qs.i. (area analita / area s.i.)
Quantità di analita
Q analita
RUMORE DI FONDO: variazione indesiderata del segnale, casuale e
dipendente dal tempo (noise); segnale non dovuto all’analita,
costante o lentamente variabile (deriva) (background).
BIANCO: campione che non contiene analita deliberatamente
aggiunto, ma contiene tutti i (o alcuni dei) componenti della
procedura analitica.
Y
analisi del bianco
N
tempo
Y
analisi del campione
N
noise
misurato
come
differenza tra il valore più alto e
quello più basso (da picco a
picco) oppure come valore
medio.
S segnale (altezza del picco).
S
tempo
Rapporto segnale su rumore :
S/N
LOD - LIMITE DI RIVELAZIONE (limite di rivelabilità, limit of detection):
la quantità di analita che produce il minimo segnale
significativamente diverso da quello del bianco.
Ylod = Yb + 3sb
Ylod
Yb segnale del bianco
sb deviazione standard del
bianco
Yb
LOD
Ylod segnale del campione al LOD
Ylod
f
3Sb
Y
determinare il LOD
dal rapporto segnale/rumore S/N
Y
S
N
LOD quella concentrazione
che produce un rapporto
segnale su rumore S / N = 3
tempo
dalla retta di calibrazione
Y = aC + b
dalla retta di calibrazione:
Ylod = a LOD + b
LOD = (Ylod - b) / a
ponendo b  Yb
LOD = (Ylod - Yb ) / a
sostituendo Ylod con la definizione di
LOD: Ylod = Yb + 3sb
LOD = 3sb) / a
LOD = 3·sb / a
Y
b + 3sb
b
C
LOD
Y
metodo 1
metodo 2
Y=aC+b
3s
Yb
C
LOD
LOD
LOD = 3s / a
LOQ = 10 s / a
il LOD dipende dagli effetti del fondo e
dalla sensibilità (a).
limite di quantificazione
Selettività :
indica quanto il metodo è libero da interferenze. Coefficiente di
selettività dell’analita A rispetto l’interferente B : K = Sb / Sa.
Specificità:
capacità del metodo di distinguere tra l’analita e le altre sostanze.
Robustezza (robustness):
capacità del metodo di resistere alle variazioni delle condizioni
sperimentali.