CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA
PRESSIONE
•Tipi
di cromatografo
•Unità
•Fase
di pressione
mobile
•Rivelatori
•HPLC
di adsorbimento
•HPLC
di ripartizione
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
La cromatografia ad alta pressione HPLC (High Performance Liquid
Chromatography o High Pressure Liquid Chromatography) si basa
sui principi generali delta cromatografia d’adsorbimento, di
ripartizione, di scambio ionico ecc.; essa permette di analizzare
miscele difficilmente risolvibili con le tradizionali cromatografie.
Le colonne HPLC hanno una maggiore risoluzione dovuta all’impiego
di fasi stazionarie molto finemente suddivise alto scopo di realizzare
una superficie di interazione molto grande ed un migliore
impaccamento, questo comporta che la fase mobile attraversi la fase
stazionaria della colonna ad una pressione molto alta per permettere
una eluizione accettabile nel tempo. Per una simile tecnica
cromatografica, la fase stazionaria, che presenta una granulometria
generalmente compresa tra 5-10 mm, deve avere requisiti particolari
per adattarsi al tipo di separazione da effettuare ed inoltre deve
avere come requisiti indispensabili:
a) essere stabile idroliticamente e termicamente;
b) resistere all’azione meccanica del flusso dell’eluente.

1.
2.
3.
4.
5.
Diversamente dalla gascromatografia, l’HPLC non separa
sostanze che si trovano allo stato di vapore, ma permette la
separazione di tutte quelle sostanze che difficilmente
possono essere vaporizzabili o che in ogni modo possano
alterarsi ad una temperatura più alta di quella ambiente; si
può affermare che la gascromatografia e l’HPLC sono due
tecniche cromatografiche che si completano a vicenda in
quanto permettono di separare i costituenti di una qualsiasi
miscela.
I vantaggi dell’HPLC possono essere cosi riassunti:
tempi brevi d’esecuzione
riproducibilità delle condizioni sperimentali
le colonne possono essere usate più volte;
possono essere analizzate miscele di sostanze tremolabili,
esplosive e non volatili.
possono essere evidenziate piccolissime quantità di
sostanze grazie all’alta sensibilità dei rivelatori che si
utilizzano;
TECNICHE CROMATOGRAFICHE

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
analiti volatili o volatilizzabili, termicamente stabili, non ionici

Gascromatografia
analiti non volatili o poco volatili, ionici, ionizzabili o non ionici,
termicamente instabili

Cromatografia liquida
analiti non volatili o termicamente instabili ma non rivelabili dai
comuni detector per LC

Cromatografia fluida supercritica
SCHEMA DI UN HPLC
HPLC IN ISOCRATICA
HPLC A GRADIENTE


Le caratteristiche di uno strumento HPLC sono
rappresentate nello schema a blocchi delle figure. II
solvente opportunamente filtrato e depurato, viene inviato
alla colonna; questa operazione viene effettuata tramite
una pompa. Un flussometro, posto dopo la pompa, regolerà
la quantità di eluente che, nelle condizioni d’esercizio scelte,
sarà immesso nella colonna.
Prima della colonna cromatografica viene posto un
iniettore, che permette l’inserimento del campione sciolto in
un solvente opportuno. Per evitare di danneggiare la fase
stazionaria della colonna é opportuno eseguire una
prefiltrazione, attraverso una analoga colonna più piccola
posta in serie, contenente lo stesso tipo di fase stazionaria
con una dimensione delle particelle più grande, allo scopo di
eliminare le impurezze grossolane, le morchie e le particelle
insolubili contenute nel campione da analizzare.
Alla fine della colonna cromatografia viene posto un
adatto rivelatore che, attraverso il cromatogramma,
darà indicazioni sull’andamento della separazione.
 Nel caso in cui si opera in isocratica é sufficiente una
sola pompa (figura 1), mentre nel caso in cui si opera a
gradiente (figura 2), è necessario usare due pompe per
mescolare i solventi ed inviarli alta colonna ad un
valore controllato di pressione, le condizioni operative,
in questo caso, verranno programmate in anticipo
tramite un calcolatore che automaticamente effettuerà
le operazioni necessarie. E’ importante osservare che,
poiché l’HPLC opera con un alto flusso di fase mobile e
quindi in condizioni di alta pressione, tutto il sistema
operativo deve essere adatto per lavorare in queste
condizioni.
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
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In particolare la fase stazionaria è posta in una colonna
cromatografica fatta con un materiale adatto per sopportare
pressioni elevate (generalmente sono d’acciaio) e la colonna
stessa deve essere inserita in una camicia all’interno della
quale sarà esercitata una pressione tale da equilibrare la
pressione esercitata dalla fase mobile all’interno della
colonna.
Nel caso di una HPLC di tipo preparativo, il rivelatore darà
informazioni sulla separazione della miscela, per raccogliere
le varie frazioni di eluito contenente le sostanze purificate.
Nel caso in cui la separazione dei vari costituenti risulterà
parziale, le frazioni raccolte che contengono i componenti
puri verranno raccolte, mentre le frazioni che contengono
ancora le sostanze in miscela verranno dirottate con un
rubinetto ed inviate alla colonna per essere nuovamente
cromatografate.
Oltre ai vantaggi precedentemente elencati per questo
tipo di tecnica, l'HPLC costituisce un sistema
cromatografico altamente efficiente in quanto:
- usa delle fasi stazionarie altamente perfezionate e
molto versatili anche per separazioni particolarmente
difficili,
- usa rivelatori molto sensibili che vengono adattati al
tipo di sostanza da separare;
- usa un alto flusso delta fase stazionaria che porta ad
una esecuzione molto rapida nel tempo ed efficace.
UNITÀ DI PRESSIONE UTILIZZATE PER L’HPLC
Per questa tecnica cromatografia, l’unità di pressione
utilizzata è il pascal (pa)
 1 pascal = 1 newton/m2 = 1x105 bar
 1 bar = 0,9869 atm = 1,01 Kg/cm2
 1 Megapascal (Mpa) = 10 bar = 9,869 atm = 10,1971
Kg/cm2
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FASE MOBILE
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
Nell’HPLC Ia fase mobile verrà scelta in funzione delle
sostanze da separare e deve presentare alcune
caratteristiche peculiari tali da non generare inconvenienti,
fra queste:
deve presentare una bassa viscosità, in quanto questo
permette di operare, all'interno della colonna, in condizioni
di pressione di eluizione non troppo elevata;
deve essere degasificato prima dell'introduzione in colonna;
la presenza di aria può modificare chimicamente le
sostanze da separare oppure dare alterazioni nella risposta
del rivelatore
deve essere puro, perchè la presenza di sostanze estranee
può danneggiare la colonna;
deve avere una temperatura di ebollizione sufficientemente
elevata per evitare fenomeni di volatilizzazione alle
temperature usate durante l'operazione cromatografica.
SELEZIONE DELLA TECNICA HPLC
ELUIZIONE ISOCRATICA O IN GRADIENTE
isocratica
isocratica
(più forte) (meno forte)
gradiente
RIVELATORI PER HPLC
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
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


Bulk properties: si misura una caratteristica della fase
mobile che indirettamente rivela gli analiti
Solute properties: si misura una caratteristica del soluto
Spettrofotometrico UV-visibile (UV-Vis)
UV-visibile con Diode-array (UV-DAD)
Spettrofotometrico IR
Fluorimetrico
Indice di rifrazione (RID)
Elettrochimico (ED)
Spettrometria di massa (MS)
RIVELATORI
I tipi di rivelatori che possono essere utilizzati per l'HPLC
sono diversi, l'uso
di ciascuno in relazione alla natura delle sostanze che
debbono essere evidenziate. E' evidente che, qualunque sia il
rivelatore usato, la fase mobile non deve in alcun
modo interferire nella determinazione ed il rumore di fondo
dello strumento non deve essere superiore al segnale più
basso dovuto alle varie sostanze da analizzare.
I rivelatori più comunemente usati sono:
•spettrofotometrici, (IR, UV ecc.), concentrazione minima
rilevabile 10-8 - 10-9 g/ml;
•fluorimetrici, concentrazione minima rilevabile 10-10 - 10-11
g/ml;
•a indice di rifrazione, un rivelatore a bassa sensibiIità
•a ionizzazione di fiamma.
RIVELATORE SPETTROFOTOMETRICO UVVISIBILE
 il
rivelatore più diffuso
(copre più del 70% dei
metodi di rivelazione)
 basato sull’assorbimento
di luce nel range UVvisibile
 sensibile a moltissime
sostanze organiche ed
inorganiche (es. 254 nm)
 sensibilità tipica: 0.1 ppb
 è un sistema non
distruttivo
GRUPPI CROMOFORI
Cromoforo
Formula
lmax (nm)
e
aldeide
-CHO
210
1.500
amino
-NH2
195
2.800
azo
-N=N-
285-400
3-25
bromuro
-Br
208
300
carbossile
-COOH
200-210
50-70
chetone
-C=O
195
1.000
disolfuro
-S-S-
194
5.500
estere
-COOR
205
50
etere
-O-
185
1.000
etilene
-C=C-
190
6.000
fenile
-C6H5
202, 255
naftile
220, 275
nitrato
-ONO2
270
12
nitrito
-ONO
220-230
1.000-2.000
nitrile
-C=N
160
-
nitro
-NO2
210
forte
SCELTA DELLA LUNGHEZZA D’ONDA
La l del rivelatore va scelta in base ad alcune
considerazioni:
massimizzare sensibilità e specificità
il solvente della fase mobile può causare shifts in lmax (2-5
nm)

controllare l’assorbanza degli analiti nella fase mobile
i
solventi per fase mobile hanno cutoff nell’UV
operando sotto la lcutoff può:
ridurre la sensibilità
 introdurre rumore sulla linea di base

RIVELATORE A INDICE DI RIFRAZIONE
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• sensibilità tipica: 0. 1 ppm
basato sulla misura
del’indice di rifrazione
dell’eluato (tipico
rivelatore bulk)
non adatto con
eluizione in gradiente
• completamente aspecifico
• necessita di termostatazione accuratissima
• si usa per composti non attivi nel range UV-visibile (zuccheri)
• è un sistema non distruttivo
RIVELATORE A INDICE DI RIFRAZIONE
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• sensibilità tipica: 0. 1 ppm
basato sulla misura
del’indice di rifrazione
dell’eluato (tipico
rivelatore bulk)
non adatto con
eluizione in gradiente
• completamente aspecifico
• necessita di termostatazione accuratissima
• si usa per composti non attivi nel range UV-visibile (zuccheri)
• è un sistema non distruttivo
RIVELATORE A INDICE DI RIFRAZIONE
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• sensibilità tipica: 0. 1 ppm
basato sulla misura
del’indice di rifrazione
dell’eluato (tipico
rivelatore bulk)
non adatto con
eluizione in gradiente
• completamente aspecifico
• necessita di termostatazione accuratissima
• si usa per composti non attivi nel range UV-visibile (zuccheri)
• è un sistema non distruttivo
HPLC DI ADSORBIMENTO
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I principi su cui si basa la cromatografia di adsorbimento sono stati
già trattati nella parte generale. Si può operare in fase normale o in
fase inversa in funzione del materiale che si usa per la fase
stazionaria. La fase stazionaria può essere caratterizzata, in relazione
alla sua struttura fisica, in due categorie:
materiale poroso sia in superficie che all’interno contraddistinto in
microporous, se la dimensione vana fra 5-10 mm;
macroporous, se la dimensione varia fra 50-100 mm
materiale, di dimensione compresa fra 20-40 mm, compatto nella
parte interna e con una pellicola porosa in superficie dello spessore
compreso fra 1-2 mm, che viene definito pellicular.
I macroporous e i pellicular vengono generalmente utilizzati per
cromatografie preparative.
I materiali più comunemente utilizzati sono: gel di silice, allumina,
poliamidi, cellulosa, acetato di cellulosa, chromosorb (polimeri del
vinil- e divinilbenzene).
HPLC DL RIPARTIZIONE
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Per questo tipo di cromatografia la fase stazionaria é
costituita da un liquido che può essere legato ad un
supporto inerte fisicamente o chimicamente. Nel caso
in cui la fase stazionaria è legata fisicamente, può
verificarsi un trascinamento di essa da parte della
fase mobile; per evitare questo, che porterebbe ad una
cromatografia non perfettamente efficiente si usa
saturare la fase mobile con la fase stazionaria.
In generale per evitare trascinamenti della fase
stazionaria si usa operare legando chimicamente la
fase stazionaria inerte che in genere è costituita da
gel di silice, in particolare vengono funzionalizzati in
vario modo i gruppi silanolici (figura 3)
ALCUNI METODI DI FUNZIONALIZZAZIONE VENGONO
RIPORTATI NELLO SCHEMA SEGUENTE:
Se si adopera come fase stazionaria silice legata
chimicamente con gruppi funzionali (bonded phase
chromatography) si può operare sia in fase normale che in
fase inversa in funzione della polarità dei gruppi legati al
supporto, si avrà così: fase normale: silice legata a gruppi
cianopropilici; fase inversa: silice legata a -C18, -C8, -fenile.
L’ordine di polarità dei vari gruppi legati alla silice varia
secondo la seguente scala di polarità: -CN > -NH2 > -C(CH3)2
> -C8> -fenile
Si può operare sia in fase normale che in fase inversa,
tenendo conto del tipo di fase mobile da usare in funzione del
tipo di fase stazionaria.