Cap. 3 La replicazione del
DNA pp. 66-89
Sintesi 03
• La replicazione del DNA è semiconservativa:
un’elica serve da stampo e viene mantenuta
invariata, l’altra viene sintetizzata ex novo.
• La replicazione richiede l’intervento di enzimi: RNA e
DNA polimerasi, ligasi, elicasi e topoisomerasi
• Nei procarioti la replicazione procede da un unico
punto iniziale, negli eucarioti ciascun cromosoma ha
varie origini di replicazione da cui iniziano sintesi
simultanee
Prova citologica della replicazione semiconservativa
Colture di cellule di porcellino
d’India
Aggiunta di 5-BUdR, analogo
della timina, con minore
tendenza a legarsi al
colorante fluorescente
Due cicli di replicazione:
1.TT, TT 2. TU, UT 3.TU, UU
Cromosomi arlecchino
La replicazione del DNA
è semiconservativa
Le DNA Polimerasi
• Possono aggiungere un nucleotide all’estremità 3’
libera di una catena di acido nucleico, se dispongono
di nucleotidi trifosfati
• Possono rimuovere un nucleotide all’estremità 3’ o
5’ di una catena di acido nucleico
• Non possono iniziare la replicazione se non
dispongono di una catena con l’estremità 3’ libera
• Non possono legare fra loro due frammenti di DNA
Le DNA P di Escherichia coli
Nella replicazione di Escherichia coli
DNA stampo (elica singola) + primer + dATP, dCTP, dGTP, dTTP
una DNA polimerasi
DNA a doppia elica
5’---(n-nucl)---3’ + dXTP 
Energia di legame
5’---(n+1-nucl)---3’ + energia
La DNAP III:
1. Allunga la doppia elica in direzione 5’—3’
2. Controlla l’appaiamento fra basi, e se è imperfetto rimuove l’ultimo
nucleotide aggiunto (attività proof-reading)
La DNAP I:
1. Degrada l’RNA nella doppia elica in direzione 5’—3’
2. Allunga la doppia elica, estendendo il frammento in direzione 5’—3’ e
rimpiazzando l’RNA stampo
La DNA PII ripara il DNA danneggiato
Inizio della replicazione; elica leading e
elica lagging
Primosoma: il complesso costituito da elicasi e
RNA polimerasi
La “bolla replicativa”
La replicazione procede nelle due
direzioni a partire dalla forcella
Frammenti di Okazaki
Meccanismo
d’azione delle
DNA P III
batteriche
Alla fine per legare fra loro i frammenti ci vuole
la ligasi
La ligasi catalizza la formazione di un legame fosfodiestereo
Schema dei passaggi enzimatici nella
replicazione di E. coli (1)
Schema dei passaggi enzimatici nella
replicazione di E. coli (2)
Schema di replicazione di
un cromosoma procariote
(nella foto, SV40)
Durante la replicazione
i superavvolgimenti
sono un problema:
girasi
Durante la replicazione i
superavvolgimenti sono un problema:
topoisomerasi
Schema dei passaggi enzimatici nella
replicazione di E. coli
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
La topoisomerasi fa rilassare il filamento
Due elicasi (una per ciascuna forca replicativa) denaturano e
svolgono un tratto della doppia elica
Le single-strand binding proteins stabilizzano il DNA ad elica
singola, senza coprire le basi
La RNA polimerasi (primasi) si lega all’elicasi e sintetizza un
innesco di circa 30 paia di basi
La DNA P III lo estende da 5’ a 3’
Ad ogni passaggio la DNA P III rimuove gli appaiamenti
sbagliati (proof-reading)
La DNA P I degrada l’innesco ed estende il frammento
adiacente, procedendo da 5’ a 3’
La ligasi salda i filamenti adiacenti, senza aggiungere alcun
nucleotide
Due eccezioni
ΦX174: DNA a singolo filamento
DNA P
DNA P
Due eccezioni
Mosaico del tabacco: RNA
DNA P*
DNA P
* DNA polimerasi RNA dipendente! (trascrittasi inversa)
Ciclo cellulare in eucarioti e procarioti (ore)
Organismo
E. coli
Lievito
Piante
Uomo
M
20’
1
1
G1
25’
8
8
S
40’
12
10
Velocità di replicazione:
E. coli: 50000 basi al minuto
Drosophila: 2600 basi al minuto
Topo: 2200 basi al minuto
G2
35’
8
5
Totale
1
2
29
24
I cromosomi
eucarioti sono
lineari, non
circolari
Nei cromosomi
degli eucarioti ci
sono varie unità
di replicazione
Progressione delle bolle di replicazione lungo il
cromosoma eucariote
ARS: Autonomous-Replication Sequences
Negli eucarioti superiori
DNA P α: sintesi dell’elica lagging e del primer
DNA P β: riparazione del DNA nucleare
DNA P γ: replicazione, solo nei mitocondri
DNA P δ: sintesi dell’elica leading
DNA P ε: riparazione del DNA nucleare
SPECIE
Dim. Genoma N repliconi velocità replicaz.
E. coli:
4,2 Mb
1
50000
Drosophila:
140 Mb
3500
2600
Topo:
3200 Mb
25000
2200
E alla fine?
Telomerasi
Le regioni terminali dei cromosomi (telomeri) contengono
sequenze ripetute:
Ciliati (Tetrahymena): n(TTGGGG)
Flagellati (Trypanosoma), uomo: n(TTAGGG)
L’enzima telomerasi contiene un tratto di RNA
complementare alla sequenza ripetuta e lo usa come
primer per replicare l’estremità telomerica 5’
Azione della telomerasi in Tetrahymena
L’efficienza della telomerasi è
incompleta. La perdita di regioni
terminali provoca forme di morte
cellulare associate all’invecchiamento
Negli
eucarioti,
sintesi e
degradazione
di cicline,
prodotte da
geni-orologio
regolano il
ciclo cellulare
Riassunto 03
• La replicazione del DNA è semiconservativa:
un’elica serve da stampo e viene mantenuta
invariata, l’altra viene sintetizzata ex novo.
• La replicazione richiede l’intervento di enzimi: RNA e
DNA polimerasi, ligasi, elicasi e topoisomerasi
• Nei procarioti la replicazione procede da un unico
punto iniziale, negli eucarioti ciascun cromosoma ha
varie origini di replicazione da cui iniziano sintesi
simultanee