Dalla sequenza alla struttura
Dalla sequenza alla struttura
V
L
S
E
G
E
W
Q
L
V
L
V
.
.
.
Sequenza
O2
Struttura
Funzione
Che informazioni offre la struttura?
•
•
•
•
•
•
Conformazione dei siti attivi e di legame
Orientazione dei residui conservati
Interpretazione di meccanismi
Visualizzazione di cavità
Calcolo di potenziale elettrostatico
…
Esempio
• FtsZ – divisione cellulare in procarioti,
mitocondri e cloroplasti.
• Tubulina – componente strutturale dei
microtubuli – comunicazione intracellulare
e divisione cellulare.
• FtsZ e Tubulina hanno bassa similarità di
sequenza e non sembrerebbero
omologhe.
FtsZ e tubulina sono omologhe?
• Proteine che hanno conservato la struttura
tridimensionale possono derivare da un
progenitore comune anche se la
divergenza della sequenza non permette
più di riconoscere l’omologia.
Burns, R., Nature 391:121-123
Picture from E. Nogales
Un altro esempio
• α-lattalbumina e lisozima possiedono:
– Stesso fold
– Moderata similarità
– Diversa funzione
ALA
TRP
PRO
Esempi di folding:
up-and-down barrel
greek key
jelly-roll
Domìni
Struttura quaternaria
Cristallografia a raggi X
• Ottenere cristalli della proteina
– 0.3-1.0 mm
– Le singole molecole sono ordinate in modo
periodico, ripetitivo.
• La struttura è determinata dai dati di
diffrazione.
Diffrazione a raggi X
Image from http://www-structure.llnl.gov/Xray/101index.html
Schmid, M. Trends in Microbiology, 10:s27-s31.
Cristallografia a raggi X
• Le proteine devono cristallizzare
– Grande quantità
– Solubili
• Accesso a radiazione adatta
• Tempo di calcolo per risolvere la struttura
Instrumentation
or synchrotron X-rays
Instrumentation
ESRF - Grenoble
Instrumentation
Elettra - Trieste
Dalla densità elettronica al modello
strutturale
+
Densità iniziale
=
Interpretazione
Struttura 3D
• La qualitá delle MAPPE dipende dalla risoluzione.
• La risoluzione dipende dalla qualitá dei cristalli.
Risoluzione
Campo magnetico
NMR
NOE (Nuclear Overhauser Effect)
Il campo magnetico
Magnete a 900 MHz
Magnete a 400 MHz
Costo commerciale di uno spettrometro a 900 MHz: ca. 5 M €
n. di spettrometri 900 MHz operativi al mondo < 10
Risonanza Magnetica Nucleare
(NMR)
•
•
•
•
•
•
Proteine in soluzione
Limite di dimensione ~ 40 kDa
Proteine stabili a lungo
Marcatura con 15N, 13C, 2H.
Strumentazione molto costosa
Tempo per assegnare le risonanze
Regions of the 1H NMR Spectrum
are Further Dispersed by the 3D Fold
What would the unfolded protein look like?
Resolve Peaks By Multi-D NMR
A BONUSregions in
2D spectra provide
protein fingerprints
If 2D cross peaks
overlap go to 3D
or 4D …..
Conformational Ensemble
Representing an NMR Structure
C
N
Pro e contro
X-ray
NMR
•
Richiede cristalli, problematico
•
•
Non ha limiti (teorici) di
grandezza
Possibile in soluzione, più
semplice
•
Limitato a proteine fino a circa
300 residui
•
Piú preciso
•
Meno preciso
•
Risoluzione
•
Numero di vincoli
•
Struttura può essere deformata
dai cristalli, rigida
•
Struttura nativa in soluzione,
flessibile
•
Una “soluzione“
•
Molti modelli
X-ray
NMR
Protein Data Bank (PDB)
•
URL: http://www.rcsb.org/pdb/
•
Coordinate 3-D di strutture proteiche
•
Formato unico
•
Tutte le strutture risolte con i raggi X e NMR
•
Più vecchia della maggior parte degli altri database
•
Strutturata male a causa dello sviluppo storico
Il Protein Data Bank
Crescita del PDB
Motivi strutturali depositati ogni anno
Superfamiglie depositate ogni anno
Formato PDB I
HEADER
COMPND
COMPND
SOURCE
SOURCE
AUTHOR
AUTHOR
...
REMARK
REMARK
REMARK
REMARK
REMARK
REMARK
REMARK
REMARK
REMARK
...
SEQRES
SEQRES
SEQRES
...
ONCOGENE PROTEIN
06-JUN-91
121P
H-RAS P21 PROTEIN COMPLEX WITH GUANOSINE-5'-[B,G-METHYLENE]
2 TRIPHOSPHATE
HUMAN (HOMO SAPIENS) CELLULAR HARVEY-RAS GENE TRUNCATED AND
2 EXPRESSED IN (ESCHERICHIA COLI)
U.KRENGEL,K.SCHEFFZEK,A.SCHERER,W.KABSCH,A.WITTINGHOFER,
2 E.F.PAI
121P
121P
121P
121P
121P
121P
121P
2
3
4
5
6
7
8
1
1 REFERENCE 1
1 AUTH
U.KRENGEL,I.SCHLICHTING,A.SCHEIDIG,M.FRECH,J.JOHN,
1 AUTH 2 A.LAUTWEIN,F.WITTINGHOFER,W.KABSCH,E.F.PAI
1 TITL
THE THREE-DIMENSIONAL STRUCTURE OF P21 IN THE
1 TITL 2 CATALYTICALLY ACTIVE CONFORMATION AND ANALYSIS OF
1 TITL 3 ONCOGENIC MUTANTS
1 REF
NATO ASI SER.,SER.A
V. 220
183 1991
1 REFN
ASTM NALSDJ US ISSN 0161-0449
2002
121P
121P
121P
121P
121P
121P
121P
121P
121P
17
18
19
20
21
22
23
24
25
1
2
3
121P
121P
121P
56
57
58
166
166
166
MET THR GLU TYR LYS LEU VAL VAL VAL GLY ALA GLY GLY
VAL GLY LYS SER ALA LEU THR ILE GLN LEU ILE GLN ASN
HIS PHE VAL ASP GLU TYR ASP PRO THR ILE GLU ASP SER
Formato PDB II
HELIX
HELIX
...
SHEET
SHEET
SHEET
...
TURN
TURN
TURN
...
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
...
HETATM
HETATM
HETATM
HETATM
...
1 A1
2 A2
LYS
SER
1 S
2 S
3 S
6 GLU
6 GLU
6 THR
1 T1
2 T2
3 T3
ALA
ILE
ALA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1324
1325
1326
1327
16
65
GLN
THR
37
49
2
11
46
83
25
74
ILE
THR
VAL
VAL
GLU
ASN
1
1
46 0
58 -1
9 1
O
N
LEU
LEU
53
6
N
O
LYS
ASP
42
54
14
49
86
121P
121P
80
81
121P
121P
121P
85
86
87
121P
121P
121P
91
92
93
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
N
CA
C
O
CB
CG
SD
CE
N
CA
C
MET
MET
MET
MET
MET
MET
MET
MET
THR
THR
THR
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
-7.176
-5.913
-5.903
-6.703
-4.712
-4.594
-3.193
-4.325
-4.966
-4.759
-4.312
32.630
31.928
30.860
30.881
32.869
33.420
34.558
35.886
29.934
28.930
29.597
-6.655
-6.676
-5.600
-4.654
-6.415
-4.990
-4.899
-4.618
-5.760
-4.751
-3.441
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
14.06
17.27
16.41
16.12
17.94
19.41
21.82
23.68
15.08
16.71
16.63
121P
121P
121P
121P
121P
121P
121P
121P
121P
121P
121P
PG
O1G
O2G
O3G
GTO
GTO
GTO
GTO
167
167
167
167
5.150
4.768
4.164
4.834
32.173
32.597
32.683
30.641
22.030
23.390
21.069
22.025
1.00
1.00
1.00
1.00
11.69
13.29
12.61
13.18
121P1427
121P1428
121P1429
121P1430
X
Y
Z
B-factor
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
CA
C
O
N
CA
C
O
CB
OG
N
CA
C
O
CB
OG1
CG2
GLU
GLU
GLU
SER
SER
SER
SER
SER
SER
THR
THR
THR
THR
THR
THR
THR
225
225
225
226
226
226
226
226
226
227
227
227
227
227
227
227
-0.900
-0.185
-0.514
0.788
1.534
2.231
1.883
2.572
3.237
3.242
3.989
4.274
4.179
5.354
5.114
6.256
-1.002
0.146
1.329
-0.203
0.805
1.806
1.952
0.130
-0.941
2.478
3.417
2.705
3.296
3.797
4.682
4.492
39.233
39.970
39.758
40.823
41.594
40.681
39.514
42.515
41.848
41.223
40.410
39.080
38.022
41.074
42.172
40.065
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
70.00
70.00
70.00
70.00
70.00
68.89
70.00
70.00
70.00
65.51
70.00
56.25
44.63
70.00
70.00
70.00
1HXN
1HXN
1HXN
1HXN
1HXN
1HXN
1HXN
1HXN
1HXN
1HXN
1HXN
1HXN
1HXN
1HXN
1HXN
1HXN
170
171
172
173
174
175
176
177
178
179
180
181
182
183
184
185