RLH e NLR:
il riconoscimento citoplasmatico del pericolo
DAMP
(Alarmins)
DAMP: Damage Associated Molecular Patterns
Come DC, Macrofagi e mastociti “sentono” il pericolo…
RLH (RIG-I like helicases)
RIG-I
retinoic acid inducible gene I
MDA5
melanoma differentiation associated gene 5
LGP2
laboratory of genetics and physiology 2
Riconoscimento di virus a RNA
Produzione di IFN di tipo I
Risposta immunitaria anti-virale
(apoptosi di cells infettate, resistenza antivirale,
prodiuzione RLH, attivazione NK & T cells)
Caspase Recruitment domain
DExD/H-containing RNA helicases
RIG-I: riconoscimento di ssRNA 5’ppp
MDA5: riconoscimento di dsRNA (poly I:C)
LGP2: inibitore dei RLH, funzione fisiologica?
Come si attiva RIG-I?
CTD --> C terminal domain, corrisponde a Repressor Domain
CTD --> contiene il dominio di riconoscimento dell’RNA
In presenza ATP --> cambio conformazione helicasi --> rilascio
di CARD --> interazioni con RIG-I/IPS
CARD dominio
responsabile
della cascata
di trasduz.
IPS (IFN promoter
stimulator 1)
o CARDIF
TRAF3 (E3
ubiquitin ligasi)
IKK-related
kinasi:
TBK-1 & IKKi
Fosforilaz IRFs
e formaz
omo/etero dim
ISRE (IFN-I
stimulated response
element)
NLR (NOD-Like Receptors):
i NOD & l’INFLAMMOSOMA
3 DOMINI:
LRR --> riconoscimento ligando
NACHT -> oligomerizzazione
CARD/PYD/… --> reclutamento
NOD1 & NOD2
Cosa riconoscono…
PEPTIDOGLICANO
- PGN: componente parete batteri
GRAM+ e GRAM- Polimero di glicani che alterna
N-acetiglucosamina (NAG) e
acido N-acetilmuramico (NAM)
-I polimeri NAM-NAG sono
collegati da ponti peptidici
GRAM negative:
Acido meso-diapinopimelico
GRAM postive:
Lysina
Come PGN entra in ocntatto coi NODs?
Batteri intracellulari con ciclo replicativo nel citosol:
LISTERIA, SHIGELLA
accesibilità DIRETTA
Batteri intracellulari che restano in fagosomi:
SALMONELLA, MYCOBATTERIO
Batteri estracellulari
TRASOPRTATORI per muramildipeptide:
CD14, PepT1, PepT2
Riconoscimento dell’Ag --> cambio conformazionale -->
oligomerizzazione via NACHT --> reclutamento di RICK (RIP2)
via CARD
Ubiquitinazione di RIP2 via TRAF (2/5; 6) --> reclutamento di
TAK1 --> formazione del complesso TAK1/TAB1/2/3
Il complesso TAK1/TAB1/2/3 induce sia l’attivazione di AP1 che
del complesso IKK,, che porta all’attivazione di NFkB
TAK1 e RIP2 portano anche all’attivazione di CARD9 e alla
conseguente attivazione di p38
Mutazioni in NODs
NOD2 --> frame-shift, induce NOD2 senza LRR
terminale (no detection di PGN):
MALATTIA
DI
CHRON,
infiammazione
aberrante a lvl intestinale, probabilm dovuta a
mancata risposta a lvl delle mucose con
conseguente induzione di risposta anti-batterica
sistemica
NOD1 --> mutazioni associate a
eczema atopico, …
ASMA,
L’INFLAMMOSOMA
LRR --> per riconscimento ligando
NOD/NACHT --> per multimerizzazione
CARD o PYD --> reclutamento caspasi
Ruolo dell’attivazione dell’INFLAMMOSOMA
Attivazione della CASPASI-1
Trasformazione di pro-IL-1 e pro-IL-18
in IL-1 e IL-18
IL-1 e IL-18
Attivazione della cascata infiammatoria
Effetto su cells immunità innata e sui tessuti
BLOCCO diffusione patogeno
IL-1
IL-1 media numerose funzioni:
a) Attivazione cells endoteliali
b) Produzione IL-6
c) Shock endotossico indotto da LPS
d) Attivazione linfociti
Proprio per i sui effetti pleiotropici la produzione di IL-1 deve
finemente regolata
La produzione deregolata o eccessiva di IL-1 può causare
danno tissutale (tossicità a lvl isole pancreas e neuroni) e
patologie infiammatorie
Doppia regolazione per la secrezione di IL-1 attiva:
1) Via PAMP e TLR viene indotta la sintesi del trascritto della
pro-IL-1
2) Un secondo segnale -INFLAMMOSOMA- induce il taglio
proteolitico della pro-IL-1 a IL-1
IL18: ruolo fondamentale nell’attivazione delle
cellule NK
In vitro exps:
wt/KO spleen
NK cells
O.N.
LPS
recombinant cytokines
neutralizing Abs
GM-CSF
wt/KO bone marrow
BM-DCs
DC-NK cell
coculture
ELISA
for
IFN-γ
IL18: ruolo fondamentale nell’attivazione delle
cellule NK
In vivo exps:
ifnb-/-, il18-/-, il2-/-,tlr4-/B6 or WT
Double transgenic B6:
Ub-GFP
DOG (CD11c promoter-DTR)
20%
80%
10-day DT treatment
ICS for IFN-γ
Lethally irradiated
Mixed BM chimera
100% GFP-DOG
-
20% KO
80% GFP-DOG
100% KO
100% GFP-DOG
-
20% KO
80% GFP-DOG
>20% KO
<80% GFP-DOG
CD11chi DCs
NK
cells/BM
cells
L’inflammosoma è una PIATTAFORMA di proteine
il cui assemblaggio porta all’attivazione della
CASPASI in grado di tagliare le pro-IL a dare le
interleukine funzionali
La base di questa
piattaforma è data dai
NLR
(14 NALP + Ipaf + NAIP)
NALP3 INFLAMMOSOMA
L’attivazione dell’inflammosoma porta alla attivazione della
CASPASI-1 o ICE (IL-1 Converting Enzyme).
ICE è il prototipo delle CASPASI INFIAMMATORIE.
Caspasi proinfiammatorie:
CASPASI 1, 4 e 5 in uomo
CASPASI 1, 11 e 12 in topo
Unico substrato noto: IL-1 e IL-18 per ICE
Quando WESTERN BLOT ha permesso di distinguere pro-IL-1
(31kD) e IL-1 (17kD) da estratti frazionati di monociti umani in
grado di indurre qto processo è stata isolata ICE
Caspasi-11 (topo) e 4/5 (uomo):
Topi resistenti a shock settico (Caspasi-1!!!)
Attivatore a monte di caspasi 1
Caspasi-12:
Selezione positiva durante evoluzione di una
forma di caspasi-12 troncata in dominio CARD
Topi ko hanno migliore clearance dei batteri e
maggiori lvl di IL-1, IL-6
IPOTESI: decoy caspasi che controbilancia
effetti caspasi-1
CASPASI -->
Cysteine proteasi che tagliano dopo un acido aspartico
originariamente scoperte nell’attivazione del porcesso
apoptotico
Tutte le caspasi esistono come zymogeni
Le caspasi “esecutive” sono le capsasi-3, -6 e -7 che sono
attivate da caspasi “iniziatrici” (2, 8, 9, 10) e che inducono
l’attivazione del processo APOPTOTICO.
Per essere attivate qte caspasi devono essere assemblate su
una piattaforma che utilizza la porteina Apaf che ha tre
domini:
1) CARD per reclutare capsasi-9
2) NB-ARC per oligomerizzare
3) WD repeat per sentire il rilascio del citocromo C dai
mitocondri
CASPASI INFIAMMATORIE attivate da NLR.
Tre gruppi principali di INFLAMMOSOMI:
Cosa induce l’attivazione di NALP:
Antrace LeTx --> azione su NALP1 (topi ko resistenti)
Forse no Pyd (--> ASC) utilizzato MA CARD-CARDINAL
PATOLOGIE ASSOCIATE A DEREGOLAZIONE NELLA
PRODUZIONE DI IL-1
CRIOPIRINOPATIE:
Sottofamiglia di sindrome febbrile periodica ereitaria (SFPE),
caratterizzata da ricorrenti fenomeni febbrili inspiegabili e processi
infiammatori molto forti.
NO segni autoimmunità (auto-Ab/T autoreative)
Mutazione MISSENSO in NACHT di NALP3 --> GAIN OF FUNCTION
--> alti livelli di IL-1 --> Pazienti rispondono a trattam con IL-1Ra
MALATTIE AUTOINFIAMMATORIE FMF E PAPA:
2 patologie dovute ad alterazione dominio PYR di NALP3.
GOTTA:
Alterazione del metabolismo delle purine --> formazione di cristalli di
acido urico (MSU) nelle genture --> attivazione NALP3 --> pazienti
rispondono a IL1Ra
VITILIGINE:
Depigmentazione della pelle per assenza porgressiva melanociti.
Associazioni genetiche a locus NALP1
Mutaz attivatoria --> maggiore IL1 --> aumentata attivazione T cells
--> cloni T autoreattivi