• In realtà gli spettri di standard e campione non
sono identici
• Si usa l’integrale spettrale
• L’integrale va calcolato in l!


F ( l ) dl
0
c
c
d  d     2 dl
l
l
Osservabili: spettro di emissione
• lecc. fissa.
• lem. variabile.
• F in funzione di lem..
Rilassamento del solvente
S1
E
S1 ’
Ass.
S0
Em.
h
h
S0 ’
Rilassamento del solvente
c-Hex
d = 10 Debye
d = 2.8 Debye
6-propionil-2-(N,N-dimetilammino)naftalene
(PRODAN)
DMF
EtOH
H2O
Rilassamento del solvente
4-dimetilammino-4'-nitrostilbene
(DNS)
H, hexane; CH, cyclohexane; T, toluene;
EA, ethyl acetate; Bu, n-butanol.
Denaturazione proteica
The use of fluorescence methods to monitor unfolding transitions in proteins.
Biophys. J. 1994 66: 482.
Partizione acqua-membrana
365
Fluorescence (a.u)
Average Wavelength (nm)
Lipid
concentration
350
400
360
0
Wavelength (nm)
100
Lipid (M)
Orioni et al., BBA 2009.
KP
200
Transizioni di fase in membrana
Transizioni di fase in membrana
GP=[F(440nm)-F(490nm)]/[F(440nm)+F(490nm)]
DMPC vesicles
6C
24
31
36
Fluorescence (a.u.)
52
60
400
450
500
l(nm)
550
0.9
0.6
0.3
0
-0.3
-0.6
0
20
Bocchinfuso et al., J. Pept. Sci., 2009
Biophys. J. 2000, 78: 290
40
T, °C
60
80
Red-edge excitation
Eccezione alla regola di Kasha!
Red-edge excitation
Segnale di fondo:
diffusione elastica ed anelastica
della luce
Perché vediamo la luce del laser
anche osservando a 90°?
Scattering Rayleigh
È una diffusione elastica.
L’energia e la lunghezza d’onda della radiazione vengono conservate.
I
1
l
4
Visione classica


μ  E
•Il dipolo indotto oscilla alla stessa frequenza
del campo applicato.
•Un dipolo oscillante emette radiazione.
•La molecola emette radiazione della stessa
frequenza di quella incidente.
Visione quantistica
Intensità (cps)
• Normalmente la diffusione
elastica non crea problemi
perché è alla lunghezza d’onda
di eccitazione (mentre la
fluorescenza è a lunghezze
d’onda maggiori).
300
350
400
450
500
450
500
• E’ dovuta essenzialmente al
solvente (Csolvente>>Csoluto). Si
può sottrarre misurando uno
spettro del solo solvente.
Intensità (cps)
l (nm)
300
350
400
l (nm)
Diffusione Raman (anelastica)
Stokes ed anti-Stokes
A T ambiente normalmente la linea antiStokes non si vede.
Visione classica
Se la molecola vibra, con
frequenza wm, la sua polarizzabilità
cambierà con la stessa frequenza.
Il dipolo oscillante emetterà a wp, wp wm,, wp +wm.
• L’energia persa dipende dai livelli vibrazionali della
molecola coinvolta.
EV
  cost. 
l0 l
hc
1
ecc. 350 nm
Methanol
Water
Intensità (u.a.)
1
380
390
400
l (nm)
410
• La differenza in energia (non l) tra luce incidente e
diffusa è costante.
EV
  cost. 
l0 l
hc
1
ecc. 350 nm
ecc. 400 nm
Intensità (u.a.)
1
300
350
400
l (nm)
450
500
Raman e fluorescenza
• Come la fluorescenza è a lunghezze d’onda maggiori dell’eccitazione
• A differenza della fluorescenza si sposta al variare della lunghezza
d’onda di eccitazione.
• Può essere spostata a lunghezze d’onda diverse da quelle di
emissione cambiando lunghezza d’onda di eccitazione.
• È dovuta essenzialmente al solvente e può essere sottratta.
Osservabili: spettro di eccitazione
• lem. fissa.
• lecc. variabile.
• F in funzione di lecc..
Se:
unico fluoroforo
F indipendente da lecc.
(unico stato eccitato).
A<<1
Allora F(lecc.) A(lecc.)
•Altrimenti: separazione dei diversi cromofori
lexc=variable, lem= fixed
lem=525 nm
lem=540 nm
lexc=510 nm
lexc=480 nm