L.S. in Scienze e tecnologie alimentari
Anno Accademico 2008/2009
Corso integrato:
Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU)
Modulo:
Chimica analitica strumentale (4 CFU)
Giorgio Bonaga
GASCROMATOGRAFIA (GC)
(CAS-3a)
Giorgio Bonaga
GASCROMATOGRAFIA (GC)
fase mobile: gas
I composti da separare (liquidi, solidi, gas) devono essere gas o resi gassosi.
Lo stato di gas si ottiene riscaldando le sostanze nel momento
dell’introduzione nello strumento e mantenendo il sistema a temperatura
elevata (solo la temperatura della colonna può essere programmata con
gradiente termico).
• CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE GAS-LIQUIDO (GLC)
fase stazionaria: liquido su solido inerte o sulle pareti della colonna
• CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO GAS-SOLIDO (GSC)
fase stazionaria: solido adsorbente
• CROMATOGRAFIA A FLUIDO SUPERCRITICO (SFC)
fase stazionaria: fluido supercritico
Giorgio Bonaga
Le soluzioni di campione vengono iniettate in un sistema la cui pressione
interna non è molto diversa dalla pressione atmosferica.
Nella GC la fase mobile è un gas che non compete con la fase stazionaria,
ma che ha semplicemente il compito di “trasportare” (carrier gas) i soluti
all’estremità della colonna. La migrazione differenziale di soluti diversi è
dovuta alle diverse interazioni soluto/fase stazionaria, ovvero alle diverse
costanti di equilibrio termodinamico Kd di soluti differenti.
Lo strumento della gascromatografia è il gascromatografo (Martin e Synge,
1941), le cui parti essenziali sono:
1. bombola del gas inerte con riduttore di pressione a due stadi, regolatore
del flusso di gas, rotametro (misuratore del flusso in entrata), separatore
di flusso, flussimetro (misuratore del flusso in uscita);
2. iniettore del campione (injector);
3. colonna cromatografica alloggiata nel fornetto (oven) dello strumento;
4. rivelatore (detector).
Giorgio Bonaga
Giorgio Bonaga
GASCROMATOGRAFO
flussimetro
detector
separatore del
flusso
Carrier gas:
injector
rotametro
He, Ar, N2, H2, CO2
riduttore regolatore
del flusso
colonna
colonna
B
OVEN
CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE
GAS-LIQUIDO (GLC o GC)
È ancora oggi la cromatografia più importante perché è quella che consente
il maggior numero di applicazioni, specialmente nel settore dell’analisi
degli alimenti, con una facile ottimizzazione delle condizioni operative. La
separazione dei soluti è dovuta alla loro migrazione differenziale lungo la
colonna per effetto delle differenti interazioni con la fase stazionaria (un
liquido immobilizzato su un supporto solido inerte o sulle pareti della
colonna). La fase mobile è solo un trasportatore (“carrier gas”), essa non
partecipa al processo di ripartizione. Ogni fase stazionaria liquida ha
caratteristiche chimico-fisiche proprie, tra le quali la pressione (o tensione) di
vapore. Nella GC, tenendo conto che la fase mobile non partecipa alla
partizione, l’unico parametro che può modificare l’equilibrio (ovvero la
costante termodinamica Kd che lo descrive) è la temperatura. Un
incremento di temperatura aumenta in modo esponenziale la tensione
(pressione) di vapore degli analiti e di conseguenza un loro più rapido
passaggio nella fase mobile. L’effetto finale è la riduzione del loro tempo di
ritenzione (un incremento di circa 30°C produce il dimezzamento del
tR).Bonaga
Giorgio
PRESSIONE DI VAPORE
Tensione di vapore
Pvapore
All’equilibrio è costante il rapporto tra il numero di molecole che dallo stato
liquido passano alla stato gassoso e il numero di molecole che dallo stato
gassoso passano allo stato liquido
Giorgio Bonaga
RELAZIONE TEMPERATURA/ENERGIA CINETICA
frazione di molecole
t1
t2
Ecmedia (t1)
liquido
Ecmedia (t2) Ec > forze intermolecolari
del liquido
PRESSIONE DI VAPORE (mm/Hg)
0°C
20°C
30°C
etere etilico
185
442
647
etanolo
12
44
74
acqua
5
18
32
Giorgio Bonaga
RELAZIONE TEMPERATURA/PRESSIONE DI VAPORE
Tensione di vapore
millibar
48,0
24,0
12,0
6,0
3,0
1,5
-30
-20
-10
0
10
20
30
t (°C)
Giorgio Bonaga
RELAZIONE TEMPERATURA/TEMPO DI RITENZIONE
tR= 4’
t
tR= 2’
t + 30°C
Giorgio Bonaga
ALLARGAMENTO DEI PICCHI IN GC
L’allargamento dei picchi è governato dall’altezza equivalente del piatto
teorico (HETP), tenuto conto che alcuni termini dell’espressione vanno
modificati sulla base delle specificità della GC:
HETP = 2 dp. l + 2 g
DDgas
m
Wc2 v + Q U dliq2 v
dp2 + d
v
D
Dgas
DDliq
m
s
Inglobando tutte le costanti caratteristiche di una determinata colonna e di
una determinata fase stazionaria (dp, l, g, dc, Q, U, dliq, Dliq) ed anche di un
determinato gas (Dgas) nelle costanti A, B e C, l’equazione può essere scritta
nella versione di Van Deemter, che correla queste costanti alla velocità
lineare media di flusso del gas di trasporto (v):
HETP = A + B + C . v
v
Verranno discussi più avanti i profili di questa equazione in relazione al
tipo di colonna GC utilizzata.
Giorgio Bonaga
LE VARIABILI DELLA GC
Nell’analisi gascromatografica, analogamente alle altre tecniche analitiche,
si deve operare una scelta delle variabili del sistema, sulla base delle
caratteristiche della miscela che bisogna analizzare. Nella gascromatografia
di ripartizione le variabili sono:
1. TIPO DI COLONNA (impaccata o capillare)
2. FASE STAZIONARIA (supporto solido inerte e liquido di partizione)
3. FASE MOBILE (tipo di gas e velocità di flusso)
4. TEMPERATURA (isoterma o programmata)
5. INIETTORE (on column, split/splitless)
6. RIVELATORE (FID, TCD, ECD, NPD)
Gli argomenti verranno trattati in riferimento alla gascromatografia
tradizionale, perchè gli ultimi sviluppi di questa tecnica (“Fast GC”, “Ultra
Fast GC” e “2DGC”) verranno illustrati separatamente.
Giorgio Bonaga
1. TIPO DI COLONNA
La classificazione fondamentale delle colonne per GC è:
1. COLONNE IMPACCATE (“Packed Colum”): sono tubi di acciaio
inossidabile, rame o vetro che vengono riempiti con una fase stazionaria
costituita da a) supporto solido (di diversa composizione e granulometria,
opportunamente trattato) sul quale si deposita b) film del liquido di partizione
(liquido alle temperature di esercizio).
2. COLONNE CAPILLARI (“Open Tubular”): sono tubi di vetro o di silice
fusa, con a) film di liquido di partizione supportato su b1) parete interna della
colonna (WCOT = Wall Coated Open Tubular), b2) strato poroso sulla parete
interna della colonna (SCOT = Support Coated Open Tubular), b3) parete
interna della colonna resa porosa (PLOT = Porous Layer Open Tubular)
3. COLONNE MEGABORE (“Open Tubular”): la loro efficienza è intermedia
tra quella delle impaccate e quella delle capillari. Hanno elevata capacità
(quantità iniettabile fino a 3 ml) e compatibilità con tutti i tipi di iniettori GC.
Giorgio Bonaga
colonne impaccate
di vetro
packed
glass column
colonne capillari di
silice fusa
capillary
fused silica column
Giorgio Bonaga
Giorgio Bonaga
vetro
fase stazionaria
(supporo+liquido)
“Open Tubular”
IMPACCATA
liquido di
partizione
silice
WCOT
strato poroso
SCOT
PLOT
CAPILLARI
CARATTERISTICHE
MEGABORE
IMPACCATE
0,32-0,53
0,53
3-6
600-1200
2000-4000
2000
500-1000
150
150
150
10
3
3000000
150000
450000
20000
3000
-
-
-
-
5-10
0,1-0,5
0,1-0,5
15-25
1-10
5-10
-
-
-
-
80-120
flusso medio (ml/min)
0,5-5,0
0,5-5,0
5-10
0,3-4,0
20-70
velocità lineare media (cm/s)
20-50
20-50
50-100
10-40
10-50
WCOT
SCOT
PLOT
diametro interno (mm)
0,32-0,53
0,32-0,53
piatti teorici/m
1000-4000
lunghezza massima (m)
piatti teorici totali (N)
fase liquida (%)
spessore fase liquida (mm)
granulometria supporto (mesh)
3,0 mm
(i.d.)
0,25-0,53 mm
(i.d.)
0,1-25 mm
(f.t.)
GC-impaccata
GC-capillare
Giorgio Bonaga
PERCENTUALE DI CARICO E RAPPORTO b
1. COLONNE IMPACCATE
Il rapporto tra la massa del liquido di partizione e la massa totale della fase
stazionaria (supporto solido + liquido di partizione) espresso in percentuale
(ossia la concentrazione percentuale in peso) è la:
% di carico = massa liquido di partizione
massa fase stazionaria
ESEMPIO
Una colonna è stata impaccata con 1,5 g di liquido di partizione e 48,5 g di
supporto solido, la percentuale di carico è 1,5/50 = 3%
2. COLONNE CAPILLARI
Il rapporto tra il diametro interno della colonna capillare e lo spessore del
liquido di partizione è espresso dall’equazione:
rapporto b =
i.d. = i.r.
4 f.t.
2 f.t.
dove: i.d. = diametro interno della colonna (in mm)
i.r. = raggio interno della colonna (= i.d./2)
f.t. = film thickness (in mm)
Giorgio Bonaga
film thickness in mm (f.t.)
diametro interno in mm (i.d.)
rapporto b =
i.d.
4 f.t.
=
i.r.
2 f.t.
Giorgio Bonaga
Maggiore è il valore del rapporto b minore è la frazione di tempo che i soluti
trascorrono nel liquido di partizione, ossia minori sono i loro tR.
Il rapporto b è utile:
1. per scegliere la colonna idonea alla soluzione di soluti da separare;
2. per confrontare le separazioni fatte con colonne di differente diametro (se
hanno lo stesso b, le separazioni risulteranno fondamentalmente uguali).
ESEMPIO
0,32 mm i.d./7,0 mm f.t.
0,32 mm i.d./0,8 mm f.t.
b
mol wt
12-100
16-350
gas, solventi, idrocarburi a bassa massa molecolare, alogenati volatili
100-320
100-700
campo delle applicazioni più comuni
320-1325
350-1500
Idrocarburi ad alta massa molecolare, cere, prodotti petroliferi
soluti da separare
0,53 mm i.d./0,1 mm f.t.
0,53 mm i.d./0,4 mm f.t.
Giorgio Bonaga
EQUAZIONE DI VAN DEEMTER
Il trasferimento dell’equazione di Van Deemter alle colonne GC deve tenere conto
delle specificità delle colonne:
1. le colonne impaccate sono riempite con un supporto inerte ricoperto dal liquido
di partizione. Rispetto l’HETP questo sistema mostra:
• un maggior effetto eddy per la tortuosità dei percorsi;
• una minore diffusione longitudinale per la resistenza offerta dalle particelle di fase
stazionaria (fattore di ostruzione = 0,6);
• maggiori trasferimenti di massa nella fase mobile per effetto della maggior
dimensione delle particelle di fase stazionaria;
• maggiore trasferimento di massa nella fase stazionaria e maggiore resistenza al
trasferimento di massa tra le due fasi (elevato “loading”).
2. le colonne capillari sono “open tubular”, con film di liquido di partizione
depositato sulle pareti della colonna o su strati porosi aderenti alle pareti della
colonna. Rispetto l’HETP questo sistema mostra:
• la mancanza dell’effetto eddy;
• una maggiore diffusione longitudinale per la minore resistenza offerta dallo strato
di fase stazionaria sulle pareti della colonna (fattore di ostruzione = 1,0);
• minore resistenza al trasferimento di massa tra il film del liquido di partizione e la
fase mobile gassosa (basso “loading”).
Giorgio Bonaga
B/v
COLONNE IMPACCATE
COLONNE CAPILLARI
HETP = A + B/v + C . v
HETP = B/v + C . v
HETP
HETP
Queste considerazioni spiegano il diverso andamento grafico delle equazioni
di Van Deemter:
C.v
A
v
B/v
C.v
v
Giorgio Bonaga
Giorgio Bonaga
2. FASE STAZIONARIA
a) SUPPORTO INERTE PER COLONNE IMPACCATE
Ha la funzione di garantire al liquido di partizione la maggior superficie di
contatto con la fase mobile. Il supporto ideale è costituito da particelle
sferiche uniformi, inerti, con buona resistenza meccanica, con un’area
specifica di 1 m2/g. In realtà di impiegano materiali diversi:
• gel di silice (da terra di diatomee)
• allumina
• carbone e carbone grafitato
• setacci molecolari (zeoliti)
• polimeri e copolimeri organici solidi porosi (resine)
gel di
diatomee
silice
allumina
carbone
zeoliti
resine
COMPOSIZIONE CHIMICA DI SUPPORTI A BASE DI SILICATI
COMPONENTE
Firebrick
C22
Celite
545
Chromosorb
P
Chromosorb
W
SiO2
89,7
89,9
89,2
91,2
Al2O3
5,1
3,6
5,1
4,1
Fe2O3
1,6
1,7
1,5
1,1
TiO2
0,3
0,3
0,3
0,3
Cao
1,3
1,8
0,9
0,7
Mgo
0,9
0,7
1,0
0,7
COMPOSIZIONE CHIMICA DI SUPPORTI A BASE DI RESINE
COMPOSIZIONE
Porapak A
etilvinilbenzene/divinilbenzene
Porapak N
polivinilpirrolidone
Porapak P
stirene/divinilbenzene
Porapak T
etilenglicoledimetacrilato
Chromosorb T
politetrafluoroetilene
Giorgio Bonaga
RESINA
CH CH2
CH CH2
CH2CH3
CH CH2
n
etilvinilbenzene
m
n
divinilbenzene
polivinilpirrolidone
Porapak A
H3C
H2C
CH CH2
CH CH2
N
O
Porapak N
O
O
C C
C
O
C
O
CH2 CH2
etilenglicoldimetacrilato
Porapak T
CH3
CH2
n
CH CH2
CH CH2
n
stirene
m
divinilbenzene
Porapak P
F F
C C
F F
n
politetrafluoroetilene
Chromosorb T
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TRATTAMENTO DEL SUPPORTO
Il materiale a base di silicati (scheletri di diatomee) viene sottoposto ad una
procedura di ottimizzazione (la sua funzione infatti è di alloggiare il
liquido di partizione, ma non produrre fenomeni di adsorbimento o di
interazione con i soluti) che prevede i seguenti passaggi:
• inattivazione (trattamento con HCl a riflusso seguito da calcinazione per
trasformare i “gruppi silanolici” in “gruppi silossanici” e per eliminare
sostanze con elevata tensione di vapore);
• fusione con NaCO3 (per garantire una cottura che produca “mattonelle”);
• triturazione (per ottenere materiale polverulento);
• setacciamento (per selezionare il supporto in base alla granulometria)
• inerzializzazione (per convertire i gruppi silanolici residui nei
corrispondenti derivati)
Giorgio Bonaga
INATTIVAZIONE
Il trattamento con HCl a riflusso trasforma i gruppi silanolici superficiali in
gruppi silossanici, mentre con la calcinazione si ottiene la rottura dei ponti
silossanici preesistenti con un aumento della porosità del supporto. La
superficie porosa del supporto consente una migliore adesione del liquido
di partizione. Sono le condizioni del trattamento idrotermico
(concentrazione di HCl e temperatura della calcinazione), unitamente alla
composizione chimica del silicato, che determinano le proprietà dei
supporti (densità libera, densità impaccata, area superficiale, pH).
O H O H
Si O
O Si O
O
Si
Si
H O
O
O
O H
O
O
Si
O Si
O H
O Si O O
O
O
H
H
gruppo silanolico
Si
O
Si
HCl
O
Si
O
Si
T (°C)
Si
poro
O
Si
gruppo silossanico
Giorgio Bonaga
SETACCIAMENTO
Si impiegano dei setacci con un diverso numero di maglie per unità di
superficie: l’unità di misura è il mesh = numero di maglie/inch2 ( 1 pollice
= 2,54 cm). L’indicazione 60-80 mesh caratterizza quelle particelle che
passano attraverso le maglie del setaccio a 60 mesh, ma vengono trattenute
dal setaccio a 80 mesh. E così via.
60 mesh
80mesh
100 mesh
80 mesh
~ 170-250 mm
Giorgio Bonaga
~ 150-170 mm
INERZIALIZZAZIONE (FUNZIONALIZZAZIONE)
Consiste nella silanizzazione dei gruppi silanolici (-Si-OH) residui con
agenti sililanti, ovvero in grado di trasformare gli –OH liberi dei gruppi
silanolici nei corrispondenti trimetilsilil-derivati (-OTMS).
CH3
Cl
Si CH
3
CH3
trimetilclorosilano
(TMCS)
CH3
O
+
H
sito attivo verso
i soluti
Cl
Si CH
3
CH3
CH3
H
CH3 Si N
CH3
Si
CH3
CH3
CH3
esametildisilazano
(HMDSA)
CH3
O Si CH + HCl
3
CH3
sito inerte
(- OTMS)
Giorgio Bonaga