Tecniche della Biologia
Molecolare
Amaldi Cap 21 (vari paragrafi)
Allison Cap 8 e 9 (vari paragrafi)
Uso di sonde di DNA per l’identificazione e
l’analisi di sequenze nucleotidiche
• Ibridazione
A saturazione
Ibridazione in situ o citologica
Southern e Northern Blot
Ibridazione su colonia o su placca
Microarray (o microchip)
Ibridazione in situ
o citologica
Microarray
Tecnologie di base per l’isolamento e la
manipolazione dei geni
Ingegneria genetica o Tecnologia del DNA ricombinante
• Enzimi di restrizione e DNA Ligasi
• Vettori di clonaggio
• Plasmidi
• Trasformazione di cellule di E. coli e selezione dei trasformanti
• Plasmidi della serie pUC: selezione blu bianco
• Vettori di espressione e produzione di proteine ricombinanti
• Batteriofago Lamda
• Cosmidi
• Vettori per il clonaggio e l’espressione in cellule eucariotiche
• Vettori di lievito
• Vettori per il trasferimento genetico in cellule animali
• Trasferimento di DNA all’interno di Vegetali
Clonaggio
Enzimi di restrizione e DNA Ligasi
Vettori di Clonaggio
•
•
•
•
Plasmidi
Cosmidi
Fagi
Cromosomi artificiali:
Lievito (YAC)
Batterici (BAC)
Plasmidici (PAC)
• Vettori di espressione in Procarioti, Eucarioti,
Piante
• Virus
Vettori di
Clonaggio
Plasmidi della
serie pUC:
selezione blu
bianco
Vettori di Espressione: E.Coli
Batteriofago
Lamda
Cosmide
Vettori di Lievito:
vettori plasmidici
Vettori di Lievito:
YAC
Banche di DNA – DNA library
• Banche genomiche
• Rappresentatività di una libreria di DNA
genomico
• Libreria di cDNA
• Identificazione del clone contenente il DNA di
interesse da una libreria
PCR – Reazione a catena della
polimerasi
• Polymerase Chain Reaction (Mullis, 1983)
• Taq Polymerase
• Ciclo di PCR:
Denaturazione del DNA
Associazione (Annealing) degli inneschi (primer)
Sintesi da parte della polimerasi
• Ciclo di PCR:
Denaturazione del DNA: 30 sec a 95°
Associazione (Annealing) degli inneschi (Primer)
30 sec a 40-60°C per favorire l’associazione
specifica degli inneschi (La temperatura deve essere di
circa 5°C al di sotto della Tm degli inneschi)
Sintesi da parte della polimerasi: 2 min a 72°C che è
la temperatura ottimale per la Taq polimerasi
RT-PCR & Real Time PCR
• RT-PCR = PCR su un campione di DNA
retrotrascritto a partire da RNA mediante
Reverse Transcriptase
• Real Time PCR = PCR in tempo reale, per
l’analisi degli amplificati (quantità) durante
l’amplificazione,
Real Time PCR
Determinazione della sequenza
nucleotidica del DNA
• Metodo chimico (Maxam & Gilbert)
• Metodo enzimatico (Sanger)
Principio del seq
Metodo chimico - Maxam & Gilbert
Metodo enzimatico - Sanger
piattaforme di sequenziamento di nuova
generazione - NGS
In Uso
• Tecnologia 454 – 454 Genome Sequencer FLX
di Roche
• Piattaforma Illumina – Genome Analyzer
• Sistema SOLiD – Applied Biosystem
Altre
• Helicos Biosciences
• ION Torrent
Tecnologia 454 – 454
Genome Sequencer
FLX di Roche
Piattaforma
Illumina –
Genome
Analyzer
Sistema
SOLiD –
Applied
Biosystem
Campi applicazioni NGS
• Sequenziamento de novo e risequenziamento
di genomi complessi
• Identificazione di siti polimorfici e mutazioni
• Analisi del trascrittoma
• Studio dell’Interazione DNA- Proteine
• Caratterizzazione del metiloma e studio
dell’editing
• Metagenomica
21.9 Valutazione dell’espressione di un
gene
21.10 Inibizione dell’espressione di
geni specifici
• RNA antisenso
• Intereferenza da RNA