Validazione di un
metodo di analisi
Validazione
 Validazione di un metodo analitico:
 “Conferma attraverso l’esame e l’apporto di
evidenza oggettiva che i requisiti particolari
per l’utilizzazione prevista siano soddisfatti”
(UNI EN ISO 9000:2000)
Quando validare un metodo?
Quando un metodo è
 non normato
 sviluppato e/o progettato dal laboratorio
 normato ma utilizzato al di fuori del proprio scopo e campo di
applicazione prefissato
 le più comiuni situazioni sperimentali che impongono la validazione
sono le seguenti:
 un nuovo metodo è sviluppato per scopi particolari;
 un metodo analitico normato deve essere aggiornato, migliorato o
esteso ad un nuovo problema analitico;
 il controllo di qualità evidenzia variazioni temporali dei parametri di
qualità;
 un metodo stabilito deve essere usato in un diverso laboratorio, da un
diverso analista, con diversa strumentazione;
 è necessario dimostrare l’equivalenza del metodo in esame con un
metodo standard.
Validazione
 Il laboratorio che utilizza un metodo
deve avere la documentazione che
dimostri l’appropriata validazione del
metodo stesso.
 È responsabilità dell’utilizzatore
assicurare che la validazione
documentata sia sufficientemente
completa
Validazione
 Non ci sono linee guida ufficiali per la
sequenza degli esperimenti necessari
per la validazione
 La sequenza ottimale può dipendere dal
metodo stesso
 E` sempre necessaria la stima
dell’incertezza di misura
Parametri che caratterizzano un
metodo analitico
 Campo di misura
 Specificità-selettività analitica
 limite di rivelabilità e di quantificazione
 range dinamico e lineare
 accuratezza intesa come esattezza più
precisione (quest’ultima a sua volta distinta
in ripetibilità, precisione intermedia e
riproducibilità)
 incertezza di misurazione
 robustezza.
Campo di misura (validità)
 Intervallo tra il più alto e il più basso
livello dell’analita determinabili con
precisione ed accuratezza applicando il
metodo stesso
 Il campo di misura (validità) è espresso
nella stessa unità di misura dell’analita
 Dipende dallo scopo del metodo
Specificità-Selettività analitica
 Specificità: Si riferisce ad un metodo che
produce una singola risposta
 Selettività: si riferisce ad un metodo che
produce più risposte (metodo separativo)
 ABILITÀ DI MISURARE ACCURATAMENTE
L’ANALITA IN PRESENZA DI
INTERFERENTI
Limite di rilevabilità
 È la più bassa concentrazione
dell’analita che può essere rilevata, ma
non necessariamente determinata
quantitativamente, nelle condizioni
sperimentali del metodo
 LdR=3*Sb/S
•
•
•
•
•
•
Sb = deviazione standard del valore del bianco (almeno 5 campioni)
S =coefficiente angolare della curva di taratura
per metodi cromatografici
Sb = D/5
dove
D = differenza tra il valore massimo ed il valore minimo del rumore di
fondo
Limite di quantizzazione
 La Più bassa concentrazione analitica
che può essere determinata
quantitativamente con accettabile
precisione ed esattezza nelle condizioni
sperimentali del metodo
 LdQ = 10*Sb/S
•
•
•
•
•
•
Sb = deviazione standard del valore del bianco (almeno 5 campioni)
S =coefficiente angolare della curva di taratura
per metodi cromatografici
Sb = D/5
dove
D = differenza tra il valore massimo ed il valore minimo del rumore di
fondo
Linearità
 La linearità di un metodo analitico è la
sua abilità di dare risultati che sono
direttamente proporzionali alla
concentrazione degli analiti nei
campioni all’interno di un determinato
campo di validità
 la proporzionalità può essere raggiunta
anche attraverso trasformazioni
matematiche ben definite
Linearità
 Deve essere verificata attraverso il calcolo del coefficiente di
correlazione della curva di taratura eseguita, quando
possibile, con aggiunte standard alla matrice da analizzare.
Curve di taratura su matrici diverse o in soluzioni standard
(contenenti soltanto il solvente e l'analita) possono essere
utilizzate previa specificazione delle motivazioni nel metodo
di prova. Sono generalmente accettati coefficienti di
correlazione (r secondo il metodo dei minimi quadrati) pari
almeno a 0,99.
 Una non-linearità significativa dovrebbe essere corretta
mediante l'utilizzo dì funzioni di taratura non lineari o
eliminata restringendo l’intervallo di concentrazioni in cui si
opera.
Linearità
 Si deve effettuare almeno da 3 a 6
repliche di 4 o più concentrazioni
 Nella validazione del metodo devono
essere riportati il coefficiente di
correlazione, la pendenza, l’intercetta e
i residui, oltre ad un grafico dei dati
sperimentali e della curva calcolata
Esattezza
 Grado di concordanza tra il valore
medio ottenuto a partire da un grande
insieme dì risultati di prova, e un valore
dì riferimento accettato
Per la valutazione dell’esattezza:
 Confronto con un metodo analitico di ordine
metrologico superiore
 Analisi di idonei materiali di riferimento
certificati a diversi livelli di concentrazione
 Confronto con i valori attesi in studi
collaborativi (circuiti interlaboratorio)
 Analisi di idonei campioni costruiti
aggiungendo alla matrice quantità certificate di
analita (Spike) a diversi livelli di
concentrazione
Ripetibilità
 concordanza tra risultati di prova indipendenti
ottenutì con lo stesso metodo su materiali
ídentici, nello stesso laboratorio, dallo stesso
operatore, usando la stessa apparecchiatura
e in intervalli di tempo brevi (stessa serie
analitica)
Per valutare la ripetibilità si possono usare:
 Campioni reali
 Materiali di riferimento certificati nella stessa
matrice
 Materiali di riferimento in matrice ottenuti per
aggiunta alla matrice stessa di soluzioni della
sostanza pura
Precisione intermedia
 Concordanza tra risultati di prova indipendenti
ottenuti con lo stesso metodo su material
identici, nello stesso laboratorio, dallo stesso
operatore, usando la stessa apparecchiatura e in
intervalli di tempo lunghi (diverse serie analitiche
con possibilità di cambiamento del lotto dei
reattivi e dei materiali di consumo).
Per valutare la Precisione intermedia si
possono usare:
 Campioni reali
 Materiali di riferimento certificati nella stessa
matrice
 Materiali di riferimento in matrice ottenuti per
aggiunta alla matrice stessa di soluzioni della
sostanza pura
Riproducibilità
 concordanza tra risultati di prova
indipendenti ottenuti con lo stesso metodo
su materiali identici, in laboratori diversi, da
operatori diversi, usando apparecchiature
diverse e in intervalli di tempo diversi
Incertezza di misura
 stima legata ad un risultato di prova che
caratterizza l'escursione dei valori entro cui si
suppone che cada il valore vero del
misurando - Ha le dimensioni di uno scarto
tipo e si indica con ”U"
valutare l’incertezza può essere
riassunto nei seguenti punti:
 specificazione del misurando (eseguita nel
metodo di prova)
 definizione della relazione che lo lega alle
grandezze misurate nel metodo di prova (ad
esempio modello matematico per la misura
della concentrazione specificato nel metodo di
prova)
 identificazione dei fattori che possono
contribuire all'Incertezza di misura per ogni
stadio del processo eseguito in laboratorio
(indicati nel metodo di prova)
 raccolta dei dati relativi alle prestazioni del
metodo (studi collaborativi, studi di
validazione in laboratorio, circuiti
inetrlaboratorio)
 quantificazione dei vari contributi
all'incertezza dai dati relativi alle prestazioni
del metodo, esprimendole come varianze o
scarti tipo (incertezze tipo):
u(xi)
 combinazione delle incertezze tipo per
ottenere l'incertezza composta:
uc(y)
 trasformazione dell'incertezza composta in
incertezza estesa
U(y) = K uc (y)
moltiplicando per il fattore di copertura (K)
In generale K=2.
Robustezza
 Insensibilità a piccole variazioni dei
parametri sperimentali
 Variazioni deliberate
% solventi organici
pH
temperatura
Flusso