Richiami di
Bioenergetica
Nei Sistemi Chimici abbiamo a
che fare col
Potenziale Elettrochimico
Il Potenziale Elettrochimico è
l’Energia disponibile nelle Reazioni
Chimiche per compiere Lavoro
Potenziale Elettrochimico
m
J/Mol
Unità = Energia/Mole
Dmo=DGo/mol
L’Energia in una Reazione
1A+1B
2C
In generale:
Dm = SNimprodotti – SNimreagenti
Ni = Rapporto Molare dei Reagenti
Per la nosra particolare reazione:
Dm = 2mC – 1mA – 1mB
All’Equilibrio:
Energia del Sistema
Dm = 0
Equilibrio
Per una Reazione che va
verso l’Equilibrio:
Dm
Energia del Sistema
Dm < 0
Dm
Equilibrio
Il Potenzale Elettrochimico è
la risultante di diversi fattori:
1) Composizione Molecolare
2) Concentrazione
3) Potenziale Elettrico
4) Pressione Osmotica, …
Energia dovuta alla
Composizione Molecolare
mo
• Energia Conformazionale
– Energia Entropica contro Stabilità dei legami
• Solubilità-Interazione con il Solvente
– Coefficiente di Partizione
• Misurata in Condizioni Standard
Condizioni Standard
Le Condizioni Standard sono le
condizioni della reazione appropriate
per l’esperimento con i reagenti ad una
concentrazione Molare:
•
•
•
•
Concentrazione 1 Molare
In Acqua Pura
pH=7
Pressione = 1 atmosfera
Energia di Concentrazione
• L’Energia del Gradiente di Concentrazione:
= RT ln([C]/Molare)
R = Costante dei Gas (Joules*Mole-1*K-1)
T = Temperatura (Kelvin, K)
Energia del Potenziale Elettrico
• L’Energia dovuta alle cariche in un Campo
Elettrico:
=zFy
z = Cariche (Moli di Carica/Mole)
y = Potenziale Elettrico (Energia/Coulomb di Carica) V = J/C
F = Costante di Faraday: 105 Coulomb/Mole di Carica
Potenziale Elettrochimico
m = mo + RT ln
[Conc]
+ zFy
[Conc]o
[Conc]o è la Concentrazione in Condizioni Standard
Cambiamento Conformazionale
A
B
All’Equilibrio:
Dm = mB – mA= 0
= (moB +RT ln([B]))-(moA + RT ln([A]))
(moB + RT ln([B]))-(moA + RT ln([A])) = 0
-RT ln ([B]) + RT ln ([A]) = moB – moA = Dmo
Cambiamento Conformazionale
A
B
All’Equilibrio:
(moB + RT ln([B]))-(moA + RT ln([A])) = 0
-RT ln ([B])-RT
+ RT
lnln
([B]/[A])
([A]) = Dmo
Risolvendo rispetto a:
[B]/[A] = exp
(-Dmo/RT) =
Keq
Distribuzione di Boltzmann
Modello di Gating del
Canale
Voltaggio-dipendenza del gating
Le particelle di gating agiscono all’interno della proteina-canale con modalità
interpretabili in termini di una distribuzione di Boltzmann.
Consideriamo un sistema a due stati nel quale ciascun canale è aperto dal
movimento di una singola particella di gating di carica z
Secondo il modello di H&H un unico movimento della particella di gating causato
da una variazione del campo elettrico provoca un cambiamento conformazionale
del canale:
Barriera
C( 1)  A( 2 )

+
Energia
Le posizioni  e  corrispondono a due minimi
nel profilo energetico e vi è una singola barriera
energetica tra di esse. In una popolazione di N
canali simili, n1 avranno la loro particella di
gating in posizione  e n2 in posizione ,
cosicchè n1+n2=N.
energetica
 +
Equazione di Boltzmann
della meccanica statistica
Mette in relazione le probabilità di una particella di trovarsi nello stato
 o nello stato  con le differenze di energia u2-u1=Du dei due stati:
P2
 u 2  u1 
 exp  

P1
kT 

k  cost. di Boltzmann
T  temp. assoluta
u2-u1 è espressa in joules
Energia
Du
Stato 1
La particella spende il minor tempo nello
stato ad energia maggiore
Stato 2
1o caso: il campo elettrico transmembrana è zero
In assenza di campo elettrico (E=0) la distribuzione di Boltzmann dell’energia
della popolazione di molecole sarà:
n2
 u 2  u1 
w 
 exp 
  exp

n1
kT
kT




Dove:
n1 il no di particelle con energia u1 in posizione (1) (canale chiuso)
n2 il no di particelle con energia u2 in posizione (2) (canale aperto),
u2-u1 è la variazione di energia libera (DG) relativa al cambio conformazionale
da 1 a 2
Quindi, in assenza di un campo elettrico la differenza di
energia conformazionale (u2-u1) tra le posizioni 1 e 2
corrisponde al lavoro chimico (w) per muovere ciascuna
particella di gating da 1 a 2.
2o caso: il campo elettrico transmembrana è  da zero
Se esiste un campo elettrico (E0) la componente energetica
posseduta dalla particella in quanto elettricamente carica sarà: -zeV
z  no di cariche in ciascuna particella di gating
e  carica elementare dell’elettrone (=4.8·10-10 ues=1.6·10-10 coulomb
V  potenziale elettrico
Quindi, includendo la componente di energia (lavoro) elettrica,
avremo:
n2
w  zeV

 exp
n1

kT



Se nel nostro sistema il canale è aperto quando la particella di
gating è in (2) e chiuso quando è in (1), C( 1)  A( 2 )
la frazione di canali aperti è anche uguale alla frazione di particelle
in (2):
Po 
n2
1

n1  n 2 1  exp w  zeV  / kT 
Ritorniamo all’equazione:
Ponendo
w
V 1/ 2 
ze
si ottiene:
Po 
1
1  exp w  zeV  / kT 
Po 
1
1  exp  ze(V  V 1 / 2) / kT 
dove V1/2 è il voltaggio V al quale metà dei canali sono aperti (Po=0.5).
Fraz. di canali aperti Po
L’equazione di Boltzmann dà una curva sigmoide in un grafico lineare di Po in funzione di V.
Quanto più elevata è z tanto maggiore è la pendenza della curva
Notare che quanto più è elevata la
carica z, tanto maggiore è la
pendenza della curva
Ricordiamo che w corrisponde al lavoro per
muovere ciascuna particella di gating dalla
posizione 1 alla 2 ovvero, la differenza di energia
tra le due posizioni in assenza di un potenziale di
membrana.
Fittando i dati sperimentali di H&H per il Na e per il K con
1
l’equazione Po 
si ottiene z(K)3.9 e z(Na) 4.8
1  exp  zeV / kT 
Z=3.9 (K)
2.5
Gmax
1
2.0
1.5
0.5
1.0
0.5
0
0
-80 -60 -40 -20
0
Voltaggio (mV)
20
40
Prob. canale aperto
C onduttanza ( m S)
Z=4.8 (Na)
Che significato ha il valore di z?
1) Semplicemente potrebbe essere la quantità di carica mossa da
un lato all’altro della membrana durante il processo di gating.
2) Potrebbero però esistere più particelle di gating per canale.
Per esempio con quattro particelle che si muovono indipendentemente, il valore di
z ottenuto applicando la precedente equazione si riferirebbe a ciascuna singola
particella e la carica di gating per l’intero canale sarebbe 4z.
Alcune definizioni…..
Dmo=DGo/mol
F/RT=eo/kT
R=8.3143 joule·K-1·mol-1
PB [ B ]

PA [ A ]
 exp(  Dmo / RT )
 exp(  DGo / kT )
 exp(  DV  F / RT )
 exp(  DV  q / kT )
k=1.38054·10-23 joule·K-1
R=NA·k (6.0222·1023 mol-1·1.38054·10-23 joule·K-1)
NA≡Numero di Avogadro: n. di molecole contenute in una mole
(6.0222·1023mol-1)
F=96490 C·mol-1
V=statVolt (299.8 volt)=erg/ues=10-7 joule/0.333 ·10-9 C
eo ≡carica elementare dell’elettrone (0.16022 ·10-18 C)
A 0 mV
L’attività del canale è caratterizzata dalla
relativa stabilità dello Stato Attivato rispetto
a quello chiuso e non dipende dalla
posizione delle cariche rispetto al campo
elettrico, dal momento che non c’è un
gradiente di potenziale elettrico.
Energia
mC)=mo(C)
mA)=mo(A)
EM
EM
Nessun Effetto
Nessun Effetto
C
m (Gate) = zG · F · 0 mV = 0
+
m (Gate) = zG · F · 0 mV = 0
+
Bagno
Membrana
EM
A
Distribuzione di Boltzmann Basata solo su Dmo
0 mV
Citoplasma
A -70 mV
L’attività del canale è caratterizzata dalla
relativa stabilità dello Stato Chiuso e
dipende dalla posizione delle cariche
rispetto al campo elettrico, dal momento che
c’è un gradiente di potenziale elettrico.
mA)
mo(A)
Energia
mo(C)
mC)
EM
Stabilizzante
C
+
m (Gate) = zG · F · -70 mV < 0
EM
Destabilizzante
m (Gate) = zG · F · 0 mV = 0
+
Bagno
Membrana
EM
A
La distribuzione di Boltzmann shifta verso lo stato C
-70 mV
Citoplasma
a +40 mV
L’attività del canale è caratterizzata dalla
relativa stabilità dello Stato Attivato e
dipende dalla posizione delle cariche
rispetto al campo elettrico, dal momento che
c’è un gradiente di potenziale elettrico.
Energia
mC)
mC)=mo(C)
mA)
mA)=mo(A)
EM
EM
Destabilizzante
C
+
m (Gate) = zG · F · 40 mV > 0
Stabilizzante
m (Gate) = zG · F · 0 mV = 0
+
Bagno
Membrana
EM
A
La distribuzione di Boltzmann shifta verso lo Stato A
+40 mV
Citoplasma
Il gating dei canali
voltaggio-dipendenti
ovvero
Come fa il voltaggio ad aprire i canali?
Il controllo dell’attività dei canali per mezzo del voltaggio è
la chiave che sta alla base dell’eccitabilità neuronale e del
signalling
Canali ionici voltaggio-dipendenti
Famiglia di canali a 6 domini transmembrana (TM)
Questa è una delle 4
(pseudo)subunità
H5
Il poro è delineato da 4 subunità o pseudosubunità
Ciascuna contiene 6 segmenti TM (S1-S6) e una regione H5 (loop P)
I canali ionici voltaggio-dipendenti contengono sensori del voltaggio intrinseci
Il segmento S4 corrisponde al sensore del voltaggio
Vi appartengono:
Canali voltaggio-dipendenti del Na+, Ca2+ e K+
Canali del K+ Ca2+-attivati
Canali cationici attivati dall’iperpolarizzazione, ecc.
K+ channel
OUT
+
+
S1 S2 S3 S4 S5
+
+
S6
IN
N
Na+ channel
X4
P
OUT
+
+
S1 S2 S3 S4 S5
+
+
C
P
S6
+
+
S1 S2 S3 S4 S5
+
+
P
S6
+
+
S1 S2 S3 S4 S5
+
+
P
S6
+
+
S1 S2 S3 S4 S5
+
+
P
S6
IN
C
N
Ca2+ channel
OUT
+
+
S1 S2 S3 S4 S5
+
+
P
S6
+
+
S1 S2 S3 S4 S5
+
+
P
S6
+
+
S1 S2 S3 S4 S5
+
+
P
S6
+
+
S1 S2 S3 S4 S5
+
+
P
S6
IN
N
C
2
2
4
4
5
5
Attiva la
spirale
Nel canale del K+ “Shaker”, ciascun segmento S4 contiene 7 residui basici
regolarmente distribuiti ogni 3 aa.
Canale chiuso: la 2a Arg di S4 è seppellita nel bilayer
Canale aperto: la 2a Arg fuoriesce dal lato extracell., mentre il 4o e 5o
residui basici si muovono dal citosol all’interno del bilayer
Il movimento del sensore del
voltaggio, facendo aprire il canale,
produce una corrente ionica
+50 mV
-100 mV
Corrente Ionica
1000 pA
Il movimento del sensore del voltaggio
produce anche una corrente di gating
+50 mV
-100 mV
Corrente Ionica
Corr. di Gating
Soluzione senza K+
1000 pA
come è possibile smascherare la
corrente di gating?
10 pA
1 ms
Il movimento del sensore del voltaggio
produce una corrente di gating
+50 mV
-100 mV
Ig = dqg/dt

qg = ∫Igdt
10 pA
1 ms
Corr. di Gating
Soluzione senza K+
Carica totale di gating
Numero dei canali
= cariche elementari /canale
Mutazioni in S4 Riducono il
Movimento di Carica
1
4
2
Dq/n
0
(e- charges)
-2
-4
K=lisina
R=arginina
2
3
4
5
6
7
ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL
R K
R neutral AA
Mutazioni in S4 Riducono il
Movimento di Carica
1
4
2
Dq/n
0
(e- charges)
-2
-4
2
3
4
5
6
7
ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL
R K
R neutral AA
Nel canale del K+ “Shaker” la presenza di 4 segmenti S4 che
fungono da sensori del voltaggio intrinseci spiega la “ripida”
dipendenza dell’attivazione del canale dal voltaggio.
Le 4 subunità identiche si muovono verso il lato extracellulare in
due fasi distinte:
1) Prima indipendentemente l’una dall’altra;
2) Poi in maniera cooperativa, portando all’apertura.
MacKinnon_Nature01473.pdf
MacKinnon_Nature01580.pdf
MacKinnon_Nature01581.pdf
Struttura del Canale K+ Voltaggio-Dipendente KvAP
da Aeropyrum pernix
La visione del
tetramero del canale
K+ è dal lato
intracellulare.
Ciascuna subunità è
colorata separatamente
e contiene 6 a-eliche
(etichettate S1-S6 alle
loro estremità Nterminali nella
subunità blu). Le
eliche S5-S6 formano
il poro e il filtro di
selettività per il K+. Le
eliche S4 formano i
sensori del voltaggio.
Gli ioni K+ sono
colorati in verde.
Struttura del Canale K+ Voltaggio-Dipendente KvAP
da Aeropyrum pernix
Visione laterale. È indicato lo spessore della membrana (40 A)
Conformazioni del Sensore del Voltaggio
Chiuso:
Vr=-100 mV
Vista Laterale: Le
linee orizzontali
demarcano
approssimativamente i
contorni della
membrana. Si
intravvedono 6 ioni
K+; K1-K4 sono nel
filtro di selettività. I
residui 196-199
comprendono il filtro
di selettività e ne è
mostrata l’ossatura in
bianco. I gruppi C=O
della catena principale
di tali residui formano
legami di
coordinazione con gli
ioni K+.
Conformazioni del Sensore del Voltaggio
Aperto:
depolarizz.
Vista Laterale: Le
linee orizzontali
demarcano
approssimativamente i
contorni della
membrana. Si
intravvedono 6 ioni
K+; K1-K4 sono nel
filtro di selettività. I
residui 196-199
comprendono il filtro
di selettività e ne è
mostrata l’ossatura in
bianco. I gruppi C=O
della catena principale
di tali residui formano
legami di
coordinazione con gli
ioni K+.
Lo stato chiuso prevale al potenziale di
riposo della cellula (~ -100 mV).
Lo stato aperto è favorito da una
depolarizzazione della membrana.
In questo modello, S2 è assunto rimanere
inalterato durante lo switch; S3a e S3b
subiscono dei riarrangiamenti sostanziali; si
ipotizza che anche la connessione tra S4-S5
sia rimodellata.
Ingrandimento del Sensore del Voltaggio
chiuso
Una Subunità,
Chiusa: Delle eliche
S2-S4 è mostrata
l’ossatura. Le
arginine che
conferiscono la
sensibilità al
voltaggio, sono
mostrate come
bastoncini colorati.
Sono mostrati anche
l’ossatura del filtro di
selettività e gli ioni
K +.
Ingrandimento del Sensore del Voltaggio
aperto
In aggiunta al
movimento della
“paletta sensore
del voltaggio",
notare nello stato
aperto la
formazione di un
ponte salino
(legame ionico)
tra l’Asp 80 e
l’Arg 133.
Accessibilità dei Residui
Nella conformazione
chiusa, i residui
evidenziati in
magenta sono esposti
allo spazio interno.
Interno
Accessibilità dei Residui
Esterno
Nella conformazione
aperta, i residui evidenziati
in rosso sono vicini allo
spazio esterno (10 Å) o si
estendono verso di esso.
La struttura del canale del K+ KvAP è descritta in:
A. Jiang Y, Lee A, Chen J, Ruta V, Cadene M, Chait BT, &
MacKinnon, R. (2003) "X-Ray Structure of a VoltageDependent K+ Channel". Nature 423: 33
I movimenti delle palette del voltaggio sono descritti in:
B. Jiang Y, Ruta V, Chen J, Lee A, & MacKinnon, R. (2003)
"The principle of gating charge movement in a voltagedependent K+ Channel". Nature 423: 42
[1ORQ.pdb & 1ORS.pdb]
FINE