Costruzione di librerie di cDNA
Costruzione di librerie di cDNA
- Lisi cellulare
- Estrazione dell’RNA
- Colonna cromatografica
cellulosa con oligodT
Costruzione di librerie di cDNA
Aggiunta di frammenti
polylinker con siti per
enzimi di restrizione per
clonaggio in vettori
plasmidici o di espressione
Costruzione di librerie di cDNA
Costruzione di librerie di cDNA
Frammenti di RNA non degradati
come primer
Oppure utilizzo di esameri random
come primer
DNA pol I
Polylinker
digestione
enzimatica
inserzione nel
vettore + ligasi
Es: libreria di cDNA del grano
GENOMICA: studio del genoma nella sua interezza
Come si ottiene la sequenza genomica completa di un organismo?
La sequenza genomica è il punto di partenza di nuove analisi per lo studio
della struttura, della funzione e dell’evoluzione sia dell’intero genoma che di
sue porzioni
I metodi di studio del genoma utilizzano:
- la bioinformatica
- la genomica comparativa
- la genomica funzionale
COME SI OTTIENE LA SEQUENZA DI UN INTERO GENOMA?
Due strategie:
- assemblaggio di cloni genomici in contigui attraverso vari metodi,
ricostruzione di una mappa lineare, sequenziamento dei cloni.
- sequenziamento casuale di un enorme numero di cloni e loro
assemblaggio in base alla sovrapposizione delle sequenze
(WGS = Whole Genome Shotgun Sequencing).
WGS = Whole Genome Shotgun Sequencing
Stringhe di 600 bp
10 letture indipendenti
sequenza consensus
di ogni specie
Metodo WGS e clonaggio in vettore con estremità note (Primer 1 e 2)
WGS = Whole Genome Shotgun Sequencing
WGS – primer walking PCR o sequenziamento di frammenti non clonati
PCR spazio breve