IL MITOCONDRIO
FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI
I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi
con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico nel quale
costantemente si fondono e si dividono
PROTEINE COINVOLTE NELLA FUSIONE
E FISSIONE DEI MITOCONDRI
PROTEINE DI FUSIONE
PROTEINE DI FISSIONE
OPA 1: Proteina dello spazio
intermembrana avente attività
GTPasica
Fis 1: Proteina della membrana
esterna
Mfn: proteina della membrana
esterna con un dominio GTPasico
e una regione Coiled coil
Drp1: Proteina citosolica e
mitocondriale avente
attività GTPasica
TESSUTI DEI MAMMIFERI ALTERATI DA DIFETTI
NELLE PROTEINE DI FUSIONE
LA BIOGENESI DEL MITOCONDRIO
Il mitocondrio contiene un
proprio genoma e apparati
distinti di replicazione,
trascrizione e traduzione.
Tuttavia l’mtDNA codifica
solo per un ridotto numero
di proteine (13) mentre il
resto è codificato dal
DNA nucleare
LE PROTEINE CODIFICATE DALL’mtDNA SONO
CONTENUTE NEI COMPLESSI RESPIRATORI
IL DNA MITOCONDRIALE DEI METAZOI
Costituisce circa l’ 1% del genoma: ogni cellula contiene
da 103 a 104 copie di mtDNA
Codifica per 2 rRNA, 13 mRNA e 22 tRNA
Si trova in strutture ricche di proteine dette nucleoidi
I NUCLEOIDI
I nucleoidi rappresentano l’unità dinamica ed ereditaria
dell’mtDNA
Vertebrati : 50 - 800 nucleoidi/cellula
2 a 6 nucleoidi / organello
2 a 15 molecole di mtDNA/nucleoide
PROTEINE ASSOCIATE CON I NUCLEOIDI NEI VERTEBRATI
Proteine coinvolte nel mantenimento, replicazione
e/o trascrizione dell’mtDNA
POL G A
POLG B
Twinkl e
MtSSB
TFAM
POLRMT
MtTFB (Xenopus )
TFB1M (uo mo)
TFB2M(uomo)
Rnase MRP
Copurif icazione
Con mt DNA
Parziale
Parziale
Parziale
Parziale
SI
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
Distribuz ione
intramitocond riale
MITOCONDRI
N.D.
NUCLEOIDI
NUCLEOIDI
NUCLEOIDI
N.D.
N.D.
MITOCONDRI
MITOCONDRI
N.D.
Proteine con funzione sconosciuta
LON proteasi
BRCA1
ANT1
PDC-E2
BCKD-E2
PHB2
Copurif icazione
Con mt DNA
N.D.
N.D.
SI
SI.
SI
SI
Distribuz ione
intramitocond riale
N.D.
NUCLEOIDI
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
Tra le proteine contenute nel nucleoide alcune hanno un ruolo noto
nel metabolismo dell’mtDNA, altre non sono apparentemente collegate
all’mtDNA dato che svolgono un ruolo a se stante.
RIMODELLAMENTO METABOLICO DEI
NUCLEOIDI MITOCONDRIALI
Studi in cellule di lievito
hanno portato alla proposta
di un modello di rimodellamento
del nucleoide secondo il quale
in seguito a cambiamenti del
metabolismo cellulare
(es situazioni di stress) l’aconitasi
perderebbe il cluster Fe-S
e si riposizionerebbe sul
nucleoide, contribuendo a
stabilizzare l’mtDNA
MODELLO DI SEGREGAZIONE DEI NUCLEOIDI IN LIEVITO
Attraverso contatti con proteine
di membrana il nucleoide
mitocondriale si collega al
citoscheletro.
In questo modo il nucleoide si
muove con i mitocondri nelle
cellule della progenie
durante la divisione cellulare
IL DNA MITOCONDRIALE DEI METAZOI
•Costituisce circa l’ 1% del genoma: ogni cellula contiene da
103 a 104 copie di mtDNA
•Codifica per 2 rRNA, 13 mRNA e 22 tRNA
•Si trova in strutture ricche di proteine dette nucleoidi
•Viene ereditato per via materna
•Viene riparato con scarsa efficienza
•Il processo di ricombinazione del DNA mitocondriale è
poco efficiente
•Nel mitocondrio esiste il fenomeno della eteroplasmia, ossia
la presenza di più di un genoma mitocondriale nello stesso
individuo
IL BOTTLENECK
La mancanza di ricombinazione del DNA mit potrebbe far
pensare che il genoma mit si comporti come un organismo
asessuato aploide, per cui l’accumulo di mutazioni deleterie
potrebbe determinare l’estinzione dell’organismo
(Muller Ratchet).
Invece esistono meccanismi specifici che prevengono questa
possibilità
Uno di questi meccanismi è detto bottleneck o
campionamento
MECCANISMO DEL BOTTLENECK
Il bottleneck rappresenta un esempio di replicazione rilassata del DNA mit
per cui durante la citochinesi alcune molecole si replicano ed altre no.
Durante i primi stadi dell’ovogenesi avviene un campionamento
delle molecole di DNA mit, fino a circa 200/cellula
Successivamente nell’ovocita primario il contenuto cellulare di mtDNA e di
mitocondri aumenta considerevolmente fino a 100000 molecole
di mtDNA/cellula.
Il campionamento (bottleneck) avviene durante lo sviluppo di un feto
femmina destinato a diventare la madre nelle generazioni successive.
Mentre le cellule germinali primordiali non differiscono nel loro livello di
eteroplasmia la drammatica segregazione dei genotipi mitocondriali che avviene
durante lo sviluppo degli ovociti primari dà luogo ad un alta varianza
intercellulare
Il campionamento avviene in modo casuale senza meccanismi di
selezione positivi o negativi
CONSEGUENZE DEL BOTTLENECK
Il campionamento dell’mtDNA porterebbe alla formazione di
individui Omoplasmici nei quali si sarebbero perse le mutazioni
debolmente deleterie prima che esse si accumulino.
Ciò eviterebbe il verificarsi del “Muller ratchet”
Tuttavia le mutazioni che sfuggono a questa selezione che
sono debolmente deleterie e che non vengono rimosse,
sarebbero amplificate e potrebbero diventare omoplasmiche
Questo è probabilmente il meccanismo per la patogenesi
delle malattie mitocondriali ereditate per via materna
MODELLO ASINCRONO DI REPLICAZIONE DEL’mtDNA
MODELLI COMPETITIVI DI REPLICAZIONE
DELL’mtDNA NEI MAMMIFERI
Replicazione
asincrona (Clayton)
Replicazione
bidirezionale
da siti multipli
di inizio
Replicazione
Unidirezionale
Sincrona (Holt 2000)
LA TERMINAZIONE PREMATURA DELLA REPLICAZIONE
DELL’ mtDNA DIPENDE DAL SUO SITO DI INIZIO
L’origine localizzata in pos 57 è responsabile per il mantenimento
dell’mtDNA in condizioni di steady state mentre le altre due origini
sarebbero richieste per il recupero dopo la deplezione dell’mtDNA e per
accellerare la replicazione dell’mtDNA in risposta a richieste fisiologiche
IL DNA MITOCONDRIALE UMANO
La replicazione dell’H-strand
(modello Clayton) inizia nella
regione non codificante e
richiede la presenza di un primer
ad RNA che è sintetizzato dalla
RNA polimerasi mitocondriale a
partire dal promotore PL.
Il principale sito di inizio della
replicazione si trova a livello di
una sequenza conservata CSB-1
che rappresenta il punto più
importante per la transizione
tra l’RNA primer e l’mtDNA
IL D-LOOP
5’ RNA
CSBs
DNA
3’
TAS
Una notevole proporzione di molecole di mtDNA di mammifero contiene
una struttura a tripla elica detta D-loop, costituita da un breve tratto di
strand H nascente appaiata alla strand L templato, con conseguente
spiazzamento della strand H materna. Le estremità 3’ del D-loop si trovano
in corrispondenza di blocchi di sequenza conservate dette TAS
E’ stato proposto che la struttura del D-loop rappresenti una replicazione
abortiva e che il numero di copie dell’mtDNA possa anche essere regolato
dall’espansione di questa struttura.
FATTORI COINVOLTI NELLA REPLICAZIONE
DELL’ mtDNA
La replicazione dell’mtDNA dipende da numerosi fattori,
ognuno dei quali svolge un ruolo importante nel processo.
SINTESI DEL PRIMER
Richiede:
•mtRNA pol
•Fattori di trascrizioneTFAM
TFB1
TFB2
TFAM
•Attiva la trascrizione delle strand H ed L legandosi ai
rispettivi promotori HSP E LSP
•Si lega al DNA anche in maniera regolare e senza specificità
di sequenza svolgendo la funzione di histone-like protein
•E’ essenziale per il mantenimento dell’ mtDNA in quanto la
sua deplezione é letale
100
TFAM
150
200
ITH
ITL
250
300
CSB3
CSB2
OH1
CSB1
OH2
350
HSP
LSP
400
450
500
550
TFAM, TFB1 E TFB2
• TFB1 e TFB2 sono due fattori proteici che insieme a TFAM
stimolano la sintesi del primer
TFB2
TFB1
TFAM
LSP
mtRNA pol.
• Sembra che TFB1 e TFB2 colleghino TFAM con l’RNA polimerasi
facilitando l’inizio della trascrizione
MATURAZIONE DEL PRIMER
RICHIEDE UNA RIBONUCLEOPROTEINA (MRP)
o
AVVIENE IN MODO PROTEINA INDIPENDENTE
L’enzima MRP è un’endonucleasi
costituita da una parte proteica
e da una componente ad RNA.
Secondo gli autori l’enzima
svolgerebbe il suo ruolo tagliando
l’RNA e producendo il primer per
la replicazione.
Il taglio avverrebbe quando l’RNA è
ibridizzato con il DNA stampo
formando una struttura R-loop
L’esistenza di strutture a singola strand nella regione
CSB1 suggerisce che esse rappresentino dei siti di pausa
della trascrizione. Pertanto la formazione del primer
sarebbe indipendente dall’azione di una nucleasi
Utilizzando un sistema
purificato di trascrizione in
vitro si è osservato che la
trascrizione della strand L
termina nel box CSB II.
Pertanto anche questo studio
sostiene che la formazione del
primer è indipendente dalla
presenza della endonucleasi MRP
LA TERMINAZIONE PREMATURA DELLA REPLICAZIONE
DELL’ mtDNA DIPENDE DAL SUO SITO DI INIZIO
L’origine localizzata in pos 57 è responsabile per il mantenimento
dell’mtDNA in condizioni di steady state mentre le altre due origini
sarebbero richieste per il recupero dopo la deplezione dell’mtDNA e per
accellerare la replicazione dell’mtDNA in risposta a richieste fisiologiche
FATTORI COINVOLTI NELLA REPLICAZIONE
DELL’ mtDNA
mtSSB
Proteina che lega il DNA a singolo filamento
evitandone la rinaturazione
ALTRE CARATTERISTICHE DI mtSSB
• stimola l’attività 3’-5’ esonucleasica e l’attività 5’-3’ polimerasica
della DNA polimerasi g. ed aumenta anche la processività dell’enzima
• La deplezione di mtSSB induce la deplezione dell’mtDNA
•Studi in Drosophila mostrano che l’espressione di mtSSB è regolata
dal legame ad elementi DRE che controllano la replicazione del DNA
di Drosophila. Ciò definisce un possibile legame tra replicazione
nucleare e mitocondriale
Il collegamento tra espressione di mtSSB e variazioni nel
contenuto dell’mtDNA suggerisce che essa sia asssociata
con meccanismi che regolano la replicazione o la stabilità
dell’mtDNA
ELICASI
E’ stata descritta una elicasi mitocondriale 5’-3’
richiesta per la replicazionedell’ mtDNA
Essa è stata denominata TWINKLE (omologa alla elicasiprimasi di T7)
• L’attività di TWINKLE è stimolata da mtSSB
• Mutazioni nel gene per TWINKLE sono associate con delezioni
multiple nell’mtDNA di pazienti sofferenti per l’adPEO
• Studi con animali transgenici e esperimenti di RNAi hanno mostrato
che l’espressione di TWINKLE è strettamente associata con il
livello dell’mtDNA
•TWINKLE, mtSSB e TFAM sono localizzate nei nucleodi
COME VIENE REGOLATA L’ESTENSIONE DEL D-LOOP ?
5’ RNA
CSBs
DNA
3’
TAS
IPOTESI
Le sequenze TAS potrebbero essere un segnale di
riconoscimento per una DNA-binding protein che potrebbe
funzionare bloccando la progressione della forca replicativa
Questa proteina potrebbe svolgere un azione antielicasica
Gli autori identificano una proteina di circa 45KDa che
si lega alle regioni TAS A E TAS B del DNA mit umano
mtDBP, THE D-LOOP BINDING PROTEIN IN SEA
URCHIN
OH
P NCR
Q
T E
12 S
F
Q
Cyt b
ND5
ND6
mtDBP
mtDBP
P.lividus
mtDNA
mtDBP
•
IS A TRANSCRIPTION TERMINATION
FACTOR
MtDBP works as a bidirectional transcription termination
factor in an in vitro heterologous transcription assay.
pDBP-term(F)
bmtDBP
-
pDBP-term(R)
-
RO
T
T
mtDBP AND mtDNA REPLICATION……..
OH
nascent H-strand
RNA primer
12S
E T
mtDBP
1098
G-rich AT P Q N
1126
1175
NCR
Is mtDBP involved in mtDNA replication, perhaps by impeding
the synthesis of nascent DNA (“contrahelicase activity”) ?
IN VITRO HETEROLOGOUS HELICASE
ASSAY
•
SV40 large T Antigen (replicative helicase)
•
Recombinant purified mtDBP
•
Partial duplex substrates that contain mtDBP
binding site alone or followed by its flanking region, in
both orientations
mtDBP
mtDBP
G-rich
G-rich
helicase
substrates
DNA-BOUND MTDBP EXHIBITS A
NON-POLAR CONTRAHELICASE ACTIVITY
Substrate: mtDBP binding site
OH
3’
DBP.For
5’
1090
mtDBP
100 °C
- + + + + + T Ag
1246
T Ag
% helicase
activity
100 86 65 37
10
mtDBP
OH
3’
5’
DBP.Rev
-
100 °C
+
+ + + + T Ag
1090
1246
T Ag
% helicase
activity
100 95 90 44
5
MTDBP IS A DUAL FUNCTION PROTEIN:
 It terminates transcription bidirectionally
 It is a bidirectional contrahelicase that
could act as a negative regulator of
mtDNA synthesis.
MtDBP could coordinate the interplay between
replication and transcription.
PROKARYOTIC FACTORS MEDIATING
TERMINATION OF TRANSCRIPTION AND
REPLICATION
Bacterial factors Tus and RTP (D. Bastia and coll.):
- block the replication fork in a polar mode (contrahelicase)
- exert a polar stop to elongating RNA pol;
passage of an RNA transcript from the permissive side of DNA-protein
complex causes dislodging of the protein: the arrested helicase is
restored.
replic.
replic.
RNApol
RNApol
blocking side
permissive side
replic.
3’
blocking side
replic.
5’
5’
Blocked RNApol
3’
What is the mechanism that allows mtDNA
synthesis to resume?
MODEL

Dissociation of DNA-bound mtDBP caused by the
passage, in the opposite direction, of the RNA
polymerase through the protein-DNA complex.
IMPACT OF TRANSCRIPTION INVASION ON
THE DNA-BOUND MTDBP
T7 promoter
mtDBP
DNA template
T7 RNA pol
T7 RNA pol transcribes and invades mtDBP-DNA complex
T7 promoter
mtDBP is dislodged and trapped by a labelled DNA
probe
32P
mtDBP
NTPs
T7 RNA pol
mtDBP
DNA template
+
_
+
+
+
+
+
+
_
+
+
+
+
_
+
+
+
+
+
+
+
_
_
_
+
_
+
_
_ mtDBP/DNA complex
_
DNA:prot.
1:6
1:13
free oligonucleotide
A POSSIBLE MODEL FOR THE ABROGATION OF
mtDBP CONTRAHELICASE ACTIVITY
arrested H-strand
OH
DNA helicase
12S
E T
G-rich AT P Q
mtDBP
mtRNA pol
Readthrough transcription
dislodges mtDBP
elongating H-strand
12S
E T
OH
G-rich AT P Q
mtRNA pol
Transcription invasion of the protein-DNA complex causes
dislodging of mtDBP. The arrested helicase is restored and
mtDNA replication can resume.
DNA POLIMERASI g
Nelle cellule animali la DNA polimerasi mitocondriale
(DNA pol g) é una proteina costituita da due subunità:
• subunità catalitica con attività esonucleasica 3’-5’
ed attività polimerasica 5’-3’ di circa 140 kDa
•subunità regolatrice di 35-54 kDa
La subunità regolatrice è omologa alle aminoacil-tRNA
sintetasi di classe II
Essa aumenta l’affinità della polimerasi per l’mtDNA e
promuove un più forte legame dei nucleotidi aumentando la
velocità di polimerizzazione
REGOLAZIONE DEL NUMERO DI COPIE DEL DNA
Il numero di copie del DNA può dipendere:
 da fattori direttamente coinvolti nella replicazione
 da fattori coinvolti nella biogenesi del mitocondrio
 da fattori coinvolti nel ciclo cellulare
REGOLAZIONE DELLA BIOGENESI MITOCONDRIALE
In risposta a danni al DNA, p53
interagisce con l’mtDNA e con la
DNA polimerasi aumentando la
velocità di replicazione
MODELLO PER LA REGOLAZIONE DEL NUMERO DI COPIE
DELL’mtDNA DA PARTE DELLA VIA DI CONTROLLO
Mec1/Rad 53 DEL CICLO CELLULARE
IL NUMERO DI COPIE DELL’ mtDNA DIPENDE DA
FATTORI PROTEICI E DA ELEMENTI LIMITANTI
COME IL POOL DEI NUCLEOTIDI
MAPPA DELLE MUTAZIONI PATOLOGICHE DEL
DNA MITOCONDRIALE UMANO (DI MAURO 2005)
ASPETTI CLINICI, MORFOLOGICI E BIOCHIMICI DI
DISORDINI COLLEGATI A MUTAZIONI DELL’mtDNA
GENI NUCLEARI COINVOLTI NEL MANTENIMENTO
DELL’mtDNA
SOSTITUZIONI AMINOACIDICHE NELLA DNA POL g
RESPONSABILI DI MUTAZIONI PATOLOGICHE O DI
POLIMORFISMI
Sporadic PEO
Male infertility
AdPEO
Mutazioni autosomiche
recessive
SANDO
Sindrome
di Alper