POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR)
-E’ UNA PROCEDURA PER OTTENERE IN
GRANDE QUANTITA’ UNA SPECIFICA
SEQUENZA DI DNA IN VITRO
-QUESTA TECNICA PUO’ AMPLIFICARE UN
TRATTO DI DNA PER PIU’ DI UN MILIONE DI
VOLTE
ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE:
1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI A
DUE REGIONI CHE SI TROVANO SU FILAMENTI
OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA
REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE
2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE
DA AMPLIFICARE
3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE
DENATURATA SE PORTATA A 95° C)
4- I 4 DESOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATI
PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO
DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI:
1- DENATURAZIONE: TEMP. 95°C. IL DNA STAMPO
VIENE DENATURATO
2-APPAIAMENTO: 55°C CIRCA. I PRIMERS SI APPAIANO
CON IL DNA STAMPO
3- SINTESI: TEMP.72°C E’ OTTIMALE PER IL
FUNZIONAMENTO DI Taq (Termus aquaticus)
POLIMERASI
PCR
PCR
VANTAGGI:
• Sensibilita’
• Rapidita’
• Si presta all’analisi simultanea di molti campioni (high
throughput)
• Si presta all’analisi simultanea di diverse sequenze sullo
stesso campione
• Si presta all’analisi di DNA degradato o incluso in mezzi
strani, o fissato
SVANTAGGI:
• Sensibilita’ (rischio di contaminazioni-falsi positivi)
• Variabile efficienza di amplificazione a seconda della
sequenza
• Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare
e messa a punto per coppie di oligonucleotidi di innesco
(primers)
• Può sintetizzare frammenti relativamente corti
• La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza(la
Taq pol non possiede attività 3’->5’ esonucleasica)
Cella elettroforetica per gel di agarosio
Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di
diversa lunghezza tramite elettroforesi
DNA
genomico
M
E6
-
E4
10
9
8
7
6
5
28S
4
3
18S
2
DNA satellite
1
7S
+
DNA satellite
Unità da 5 a 200 bp.
Segmenti lunghi fino a qualche centinaio di chilobasi
Trasferimento secondo Southern
(Southern blot)
SOUTHERN BLOT
Altra forma di ibridazione su membrana: il dot blot
(sia con campioni di RNA che di DNA)
A
B
C
D
1
1
2
3
4
2
5
6
7
8
3
9
10
11
12
4
13
14
15
16
Dot blot
Polimorfismi del DNA: SNP (single nucleotide polymorfism)
---ATGTTGAAGTTCAAGAATTCTGTGCGGAAC-----ATGTTGAAGTTCAAGTATTCTGTGCGGAAC-----ATGTTGAAGTTCAAGCATTCTGTGCGGAAC-----ATGTTGAAGTTCAAGGATTCTGTGCGGAAC---
Polimorfismi del DNA: microsatelliti
Minisatelliti
Unità fino a 5 bp. Segmenti lunghi fino a 25 kb
Allele A TACCAAGGTACGGACGGACGGACGGGGTACCATGG
Allele B TACCAAGGTACGGACGGACGGACGGACGGGGTACCATGG
Microsatelliti
Unità < 4bp. Segmenti lunghi fino150 bp
Allele A TACCAAGGTACACACACGGTACCATGG
Allele B
TACCAAGGTACACACACACGGTACCATGG
Allele C
TACCAAGGTACACACACACACGGTACCATGG
Allele D
TACCAAGGTACACACACACACACGGTACCATGG
Come evidenziare i polimorfismi?
RFLP= restriction fragment length polymorphism
Gli RFLP possono evidenziare sia polimorfismi dovuti a mutazione
di singoli nucleotidi sia polimorfismi di tipo minisatellite (VNTR =
Variable Number of Tandem Repeats)
I polimorfismi di tipo microsatellite possono essere evidenziati
mediante PCR (STRP = Short Tandem Repeat Polymorphisms)
Applicazioni di Southern e PCR
Mappatura del genoma umano
Indagini di medicina forense
Quando il materiale biologico è
troppo scarso o di qualità
scadente, può essere utile
analizzare i polimorfismi del DNA
mitocondriale (moltissime copie
per cellula)
Diagnosi di mutazioni concatenate con marcatori RFLP
A volte la mutazione patogena può abolire o creare un sito di restrizione
A volte la mutazione patogena può abolire o
creare un sito di restrizione specifico
L’utilizzo combinato della PCR e dell’analisi di
restrizione permette di diagnosticare specifiche
mutazioni molto più facilmente che con il Southern Blot
Diagnosi di mutazioni mediante dot-blot e ibridazione
con oligonucleotidi allele-specifici
P1
bA
P1
P2
bS
P2
PCR
Diagnosi di mutazioni mediante dot-blot e ibridazione
con oligonucleotidi allele-specifici
Diagnosi di mutazioni mediante amplificazione allele-specifica
Diagnosi di mutazioni mediante amplificazione (di
DNA genomico o cDNA) e sequenziamento diretto.
L’utilizzo simultaneo della PCR e di traccianti
fluorescenti consente l’analisi simultanea (multiplex) di
moltissimi polimoprfismi
Diagnosi genetica pre-impianto
Diagnosi genetica pre-impianto
Diagnosi genetica pre-impianto
Possibile già oggi per malattie monogeniche per cui
sia nota la mutazione
In futuro, almeno in teoria, è probabile che questa
tecnica, in combinazione con l’analisi simultanea di
moltissimi polimorfismi, possa permettere una
valutazione di tratti genetici complessi.
Quali i vantaggi, e quali i pericoli?
La PCR può essere usata per misurare
l’espressione genica:
RT-PCR
•Estrazione di mRNA
•Sintesi del cDNA utilizzando trascrittasi inversa
(priming possibile con oligo-dT, oligo random o
primer specifico)
•Amplificazione con oligonucleotidi specifici
•Elettroforesi su gel di agarosio
Caratteristiche dell’RT-PCR
• E’ in assoluto la tecnica più sensibile, in quanto utilizza la PCR.
• Non richiede purificazione dell’mRNA
• Richiede pochissimo RNA di partenza (si può partire da qualche
decina di cellule)
• Semplice e rapida
• Funziona anche su RNA parzialmente degradato
• Non da informazioni sul peso molecolare dell’mRNA
• Non è quantitativa a meno di non usare particolari accorgimenti
Time PCR
RealRealtime
PCR
Recentemente è stata sviluppata una nuova metodica: la Real Time PCR.
Questa consente di seguire la cinetica di reazione nel tempo ed è quindi
estremamente quantitativa.