Nature 213, 399-400 (28 January 1967)
Reduction of Methaemoglobin in Haemoglobin Samples using Gel Filtration
for Continuous Removal of Reaction Products
H. B. F. DIXON & R. McINTOSH*
1.
2.
Department of Biochemistry, Cambridge.
*Medical Research Council Abnormal Haemoglobin Research Unit.
Abstract
EVEN a small degree of oxidation of haemoglobin to methaemoglobin, such as occurs in the transport
and storage of frozen red cells, interferes with the study of its oxygen dissociating properties. When
abnormal are separated from normal haemoglobins, even more methaemoglobin accumulates during
the manipulations involved. The methaemoglobin may be efficiently reduced by passing a haemolysate
of such a partly oxidized sample by means of gel nitration through a band of reducing agent.
Advantages of this method are that the methaemoglobin constantly encounters fresh reducing agent
and that the continued elution quickly removes the haemoglobin formed from excess reagent. These
factors are important when reduction is by dithionite, as side reactions can then destroy the
haemoglobin. A similar principle can be applied to the oxidation of cytochromes 1, and to the
conversion of the aldimine form of aspartate aminotransferase (E.C. 2.6.1.1) into the amino form by
transamination with an amino-acid2. The continuous removal of the -oxoacid formed is particularly
important in the latter case because the position of equilibrium is unfavourable to formation of the
amino form.
CROMATOGRAFIA
Tecnica di separazione di molecole tra FASE STAZIONARIA
FASE MOBILE
La separazione si ottiene perché le sostanze migrano con diversa
velocità attraverso la fase stazionaria
La migrazione è provocata dal flusso della fase mobile o eluente
FASE STAZIONARIA
Particelle di determinate dimensioni impaccate su colonna
o stratificate su un supporto solido (strato sottile)
FASE MOBILE
Viene fatta scorrere attraverso la fase stazionaria
SOSTANZE
Vengono trasportate lungo la fase stazionaria dalla fase mobile
CROMATOGRAFIA AD ADSORBIMENTO:
CROMATOGRAFIA DI PARTIZIONE:
le sostanze interagiscono con la superficie delle
particelle costituenti la fase stazionaria
le sostanze si separano in base alla diversa ripartizione
tra fase stazionaria e fase mobile
GEL CROMATOGRAFIA (ad esclusione molecolare): La fase stazionaria è rappresentata
da un GEL, attraverso cui scorre l’eluente
GEL: viene preparato permettendo il rigonfiamento delle particelle in eccesso di eluente
Generalmente la matrice del gel possiede gruppi idrofilice (-OH)
Il gel viene impaccato mediante il passaggio di eluente attraverso di essa
Sephadex
E’ costituito da DESTRANO, un polisaccaride costituito
da residui di glucosio
Viene prodotto da ceppi differenti di Leuconostoc mesenteroides
che crescono in un medium contenente saccarosio
Successivamente il destrano viene polimerizzato
con EPICLOROIDRINA
Tre stadi nel corso
della separazione
low molecular weight
high molecular weight
Gel particles
Principio di ripartizione: le molecole piccole possono entrare nel gel attraverso i grani
della fase stazionaria (equilibrio dinamico)
le molecole più grosse passano attraverso i grani di gel senza interagire
con esso
il sistema può essere complicato a causa di particolari
interazioni con la matrice del gel
ESERCITAZIONE
Na2S2O4
K 3Fe(CN)6
Sangue
+3
6Fe3++S2O42-
metaemoglobina
emoglobina
Fe(III)
marrone
Fe(II)
rosso porpora
4H2O
emoglobina ossigenata
rosso
+6
2SO42- + 8H+ + 6Fe2+
1) Aggiungo prima ditionito di sodio
2) Poi metaemoglobina
metaemoglobina
ditionito
marrone
rosso porpora
rosso
Principio
La metaemoglobina è più veloce e raggiunge il ditionito tornando
allo stato di ossidazione Fe(II) assumendo quindi la colorazione rossa
e successivamente rosso più chiaro grazie alla presenza di molecole di
ossigeno presenti all’interno della colonna