UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI ROMA
“TOR VERGATA”
EFFETTI APOPTOTICI DI
ORIGANUM VULGARE IN
CELLULE TUMORALI DEL COLON
Relatore
Prof. Luciana Avigliano
Candidata
Laura Masciullo
FATTORI GENETICI
FATTORI AMBIENTALI
CANCRO DEL COLON
DIETA MEDITERRANEA: BASSO RISCHIO
Elevato consumo ortaggi, frutta, spezie, legumi, cereali
DIETA OCCIDENTALE: ALTO RISCHIO
basso consumo di prodotti di origine vegetale
L’origano è ampiamente utilizzato in tutti i
paesi del bacino mediterraneo
SCOPO DELLO STUDIO
Effetti chemiopreventivi dell’Origanum vulgare:

proliferazione cellulare

stato redox

apoptosi
CELLULE UMANE
MODELLO SPERIMENTALE:
Cancerose: cellule di adenocarcinoma del colon (Caco2)
Normali: colture primarie di fibroblasti e colonociti (FHC)
PREPARAZIONE DELL’ESTRATTO DI ORIGANO

FOGLIE E FIORI ESSICCATI FRANTUMATI FINEMENTE

ESTRAZIONE CON ETANOLO 70% PER 24 ORE A 4°C, AL BUIO

FILTRAZIONE SU CARTA WHATMAN NO. 1

CENTRIFUGAZIONE A 2500 RPM PER 20 MIN

CONCENTRAZIONE DEL SUPERNATANTE SOTTO FLUSSO D’AZOTO

ESTRATTO DI ORIGANO LIOFILIZZATO
Resa:
20 %
(2.5 gr di origano essiccato = 0.5 gr estratto secco)
Caratterizzazione dell’estratto origano
Contenuto Totale Fenolico (Metodo Colorimetrico Folin-Ciocalteu):
150 mg di acido gallico equivalenti/gr di estratto secco
Capacità Antiossidante Totale:
2.4 ± 0.2 mmol di Trolox equivalenti/g di estratto secco
Composti fenolici
flavonoidi
stilbeni
flavoni
acidi fenolici
lignani
flavanoni
flavanoli
antocianine
flavonoli
isoflavoni
monoterpeni
ANALISI COMPOSTI FENOLICI
(HPLC con rivelatore a fotodiodi  = 310 nm)
800.00
Acido rosmarinico
700.00
600.00
500.00
400.00
Acido ferulico
300.00
Daidzeina
Acido caffeico
200.00
Esperetina
100.00
0.00
0
5
10
15
20
25
minuti
30
35
40
45
50
Composti fenolici identificati mediante analisi
cromatografica (HPLC-DAD)
FENOLI
TEMPO DI
RITENZIONE
(min)
(mg/g di estratto secco)
%
FENOLI
Acidi fenolici
26.7
55.20±6.00
31.80
Naringenina
Flavononi
30.0
34.32±1.00
19.82
Esperetina
Flavononi
34.1
2.35±0.11
1.36
Acidi fenolici
21.0
1.40±0.12
0.81
Carvacrolo
Terpeni
42.0
1.30±0.09
0.75
Ac. gallico
Acidi fenolici
2.1
0.61±0.06
0.34
Acido caffeico
Acidi fenolici
15.0
0.81±0.08
0.46
Ac.clorogenico
Acidi fenolici
13.1
0.72±0.08
0.41
Flavanoli
11.2
0.21±0.02
0.11
Flavoni
40.5
0.33±0.03
0.20
Ac.protocatecuico
Acidi fenolici
6.8
0.32±0.02
0.17
Ac. ferulico
Acidi fenolici
24.3
0.15±0.01
0.08
Daidzeina
Isoflavoni
31.2
0.07±0.007
0.04
Altri fenoli
---
---
71.24±10.0
41.18
173±12.00
100
Ac. rosmarinico
Ac. cumarico
(+) Catechina
Diosmetina
FENOLI TOTALI
CLASSE
CONCENTRAZIONE
L’origano esercita differenti effetti sulle cellule
normali e cancerose
FHC
% del controllo
% del controllo
FIBROBLASTI
CaCo2
300 mg/ml
120
100
80
60
40
20
0
*
12
24
#
#
48
ore
72
120
100
80
60
#
12
# p<0,001
500 mg/ml
*
#
#
40
20
0
* p<0,05
*
24
ore
48
#
72
L’origano promuove l’arresto della crescita nella
fase G2 prevenendo l’entrata in mitosi e
inducendo morte cellulare
Analisi al citofluorimetro
280
Eventi
350
Ctrl
Ipodiploide
G0/G1
210 G2/M
S
origano
280
10%
49%
14%
37%
Eventi
350
140
70
0
100
Ipodiploide
G0/G1
210 G2/M
S
24%
31%
30%
39%
140
70
101
102
FL2-H
103
104
0
100
101
102
FL2-H
103
104
L’origano induce sia la necrosi sia l’apoptosi
Colorazione con ioduro di propidio ed analisi al FACS
12 %
Ctrl
Necrosi
13 %
Apoptosi
18 %
origano
Necrosi
Normale
30 %
Apoptosi
Normale
L’origano attiva le caspasi esecutrici
Ctrl
origano
PARP (89 kDa)
Volte su controllo
caspasi 3 (17 kDa)
3
Ctrl
*
2
origano
*
1
0
PARP
Casp-3
*
p<0,001
L’origano attiva la via intrinseca e la via
estrinseca dell’apoptosi
Via recettoriale
caspasi 8 (18 kDa)
APAF-1 (130 kDa)
pro-caspasi 9 (47 kDa)
Via mitocondriale
Bak (25 kDa)
pro-apoptotico
Bcl-xL (30 kDa)
anti-apoptotico
tubulina
Volte su controllo
5
Ctrl
origano
#
4
3
#
2.5
2
3
2
* p<0,05
1.5
*
*
1
1
0
#
Casp-8 APAF-1 Pro casp-9
0.5
0
Bak
Bcl-xL
# p<0,001
L’origano promuove una perturbazione nel
potenziale di membrana mitocondriale
Colorazione con JC-1 ed analisi al FACS
Ctrl
Fluorescenza (unità arbitrarie)
origano
Ctrl
origano
L’origano riduce il glutatione totale ed
incrementa il GSSG
nmoli Trolox eq./mg proteina
Capacità antiossidante totale
Livelli di ROS
Ctrl
origano
Glutatione ossidato
GSSG/GSH x 100
(nmoli/mg proteina)
Glutatione totale
Glutatione totale
Origano 36%
Ctrl 32%
Ctrl
origano
Ctrl
origano
L’estratto di origano promuove:
Alterazione dello
stato redox
Attivazione delle vie
apoptotiche
Arresto della crescita e morte cellulare
CONCLUSIONI
Tali effetti non sono ascrivibili ad un singolo componente,
ma all’alimento “in toto”
I colonociti sono le cellule che “in vivo” entrano a diretto
contatto con la spezia
Gli effetti anti-tumorali si ottengono con
quantità di origano raggiungibili con la
dieta Mediterranea
100 mg
La diffusione dell’origano potrebbe essere
correlata a questi effetti benefici
Gli effetti protettivi dipendono dall’estratto “in toto”
e non dai singoli componenti
volte su controllo
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
volte su controllo
1,20
* p<0,001
1,00
0,80
*
0,60
*
0,40
0,20
0,00
CTRL
ORI 500
MIX 13