TESTI UTILI
GENETICA MOLECOLARE
•Strachan T., Read A.P
Genetica Umana Molecolare (UTET)
(Human Molecular Genetics 3, Gardland Science)
GENETICA STATISTICA
•Ott J (1999) Analysis of human genetic linkage.
Johns Hopkins University Press, Baltimore
•Sham P (1997) Statistics in human genetics.
Arnold; Wiley, London, New York
VARIABILITA’ DEL GENOMA E MUTAZIONI
•Replicazione del DNA -> errori -> meccanismi di riparo (non effic. al 100%)
Tasso di mutazione per nucleotide nell’ordine di 1/109
•Agenti esterni (mutageni, radiazioni etc)
MUTAZIONI
cambiamenti stabili (ereditabili) nella sequenza del DNA
Se una mutazione insorge in una porzione del DNA codificante o funzionalmente
importante può avere un effetto sul fenotipo.
variabilità -> evoluzione
Mutazioni patogeniche -> malattie genetiche
Possono insorgere a livello di:
• cellule somatiche (-> cancro, invecchiamento)
• cellule germinali
POLIMORFISMI
presenza nella popolazione di 2 o piú varianti alleliche,
con una frequenza significativamente alta (> 1%)
MUTAZIONI SEMPLICI (puntiformi)
causate per lo più da errori spontanei nella replicazione del DNA e riparo
EFFETTI PATOGENI DELLE MUTAZIONI PUNTIFORMI
Nella regione codificante di un gene
Sostituzioni sinonime (silenti) La > parte sono neutrali. Talvolta possono creare degli errori di splicing
Sostituzioni non sinonime (missense) Spesso deleterie.
Nonsense: quasi sempre deleterie.
proteina troncata
mRNA instabile (nonsense-mediated mRNA decay)
exon skipping (raro)
Inserzioni/delezioni -> Framshift -> in genere introducono un codone di stop
Introni
• mutazioni di splicing
• assenza di splicing dell’introne
• uso di un sito di splicing illegittimo (criptico)
• exon skipping
Mutaz nel 5’ o 3’ non tradotto
es: nel segnale di poliadenilazione AAUAA
siti target di microRNA
Mutazioni in regioni regolatorie
Riarrangiamenti mediati dalla presenza di
SEQUENZE RIPETUTE
• Slipped strand mispairing
• Crossing-over ineguale
SEQUENZE RIPETUTE
DNA CODIFICANTE:
•Famiglie multigeniche
•Motivi strutturali conservati
•Ripetizioni in tandem di geni per rRNA e istoni
DNA NON CODIFICANTE
•In tandem
•Sequenze ripetute intersperse
1) Famiglie geniche
• duplicazione e divergenza da un gene ancestrale
es. geni globinici
• Famiglie di geni con regioni conservate che codificano per domini funzionali
Es fattori di trascrizione (Homeobox, Zinc-finger etc)
PSEUDOGENI copie non funzionali
Non-processati (espressi/non espressi)
Processati
2) Sequenze ripetute extrageniche
•Ripetizioni in tandem
1)Altamente ripetuto -> DNA satellite
2) Polimorfiche:
minisatelliti
microsatelliti
•Seq ripetute intersperse
Alu
DNA SATELLITE
LINEs (L1)
LINEs
> 5 kb
104
Kpn o L1- 6.1kb, molte sono forme troncate al 5’
2 ORF, ORF1 = RNA binding prot, ORF2 = RT e endonucleasi
SINEs
<500 bp
105
Alu - 2 ripetizioni di una seq di ~120 bp
~ ogni 4 kb
omologia con 7SL RNA-> propagate tramite retrotrasposizione
Propagazione delle LINEs e SINEs tramite retrotrasposizione
1)SLIPPED STRAND MISPAIRING
Appaiamento sfasato di corte sequenze ripetute in tandem
Causa piccole delezioni/inserzioni (che possono essere patogene o generare polimorfismi STR )
Crossing-over ineguale (NAHR: non-allelic homologous recombination)
Direct repeats :
deletion and/or
duplication
Inverted repeats :
inversion
Segmental duplications
LCR (low copy repeat)
Sequenziamento del genoma -> presenza di duplicazioni di
sequenze 10-400Kb, con alta similarità (>95-97%).
Rappresentano almeno il 5% genoma
Inter-cromosomiche (soprattutto in reg pericentrom e subtelomeriche
Intra-cromosomiche (cromosoma specifiche)
Causa di riarrangiamenti genomici associati a malattie genetiche
Smith Magenis Syndrome, Charcot-Marie-Tooth (crom 17) Prader-Willi/Angelman Syndrome
(crom 15).
•Regioni pericentromeriche e subtelomeriche contengono alto num di segmental
duplications
Genomic Disorders
Patologie che derivano da riarrangiamenti di una regione di DNA, causati da ricombinazione omologa
ineguale tra LCR
-> delezione o duplicazione di 1 o + geni sensibili al dosaggio, o inattivazione di uno specifico gene
1) Membri di famiglie geniche/peudogeni ripetuti in tandem
Es: Talassemiaalfa-globina
Daltonismo
pigmenti rosso/verde dei coni
2) Sequenze ripetute che fiancheggiano geni
Charcot Marie Tooth (CMT-1A)
Ittiosi X-linked
Smith Magenis
Williams Syndrome
PMP22
STS
3) Sequenze ripetute inverse
Emofilia A
Fattore VIII
Polimorfismi
•Presenza nella popolazione di 2 o piú varianti alleliche di un gene o una
determinata sequenza di DNA
•Allele più raro frequenza maggiore 1%
•La > parte di polimorfismi sono neutrali, non hanno un effetto sul fenotipo
TIPI DI POLIMORFISMI PIU’ COMUNI
•Cambiamenti di una singola base (SNPs)
•Inserzioni o delezioni di piccole dimensioni
•Variazione nel numero di sequenze ripetute in tandem
•microsatelliti (Short Tandem Repeats)
•minisatelliti (VNTR)
SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)
•Differenze di singola base
•Biallelici
•Più frequenti varianti di DNA (circa 1/300 bp)
•Sviluppo di tecniche di genotyping automatizzate e in
larga scala
•Basso tasso di mutazione in confronto ai microsatelliti
Varianti
Seq DNA
Variabilità
fenotipica
Predisposizione a malattie
Caratteristiche fisiche
Risposta a influenze ambientali
Risposta a farmaci
DbSNP http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/
SNP variation in humans
Number of SNPs in dbSNP
total non-redundant
SNPs
~ 10 million common
SNPs in the human
genome
double hit
validated by
genotyping
Nature 437:1299 (2005)
•Microsatelliti (STR Short Tandem Repeats)
Classe di sequenze ripetute, costituite da ripetizioni in tandem di 2-3-4 pb
Fiancheggiate da sequenze uniche
Es: Ripetiz di dinucleotidi CA/GT CT/AG
Molto polimorfici e uniformemente distribuiti nel genoma (1/50-100 Kb)
-> utili come marcatori genetici
•Minisatelliti
•ripetizioni in tandem di una corta sequenza (10-100 bp)
•distribuzione non omogenea (vicino ai telomeri)
•sequenza comune (core) GGGCAGGAXG + seq specifiche
Molto polimorfici : utili come marcatori per mappe genetiche ma distribuz non omogenea
Utilizzati in passato per DNA FINGERPRINTING
(descritti da Jeffreys)
Genetic variation in the human genome
Tecniche citogenetiche -> anomalie cromosomiche (> 3 Mb)
Tecniche molecolari (sequenziamento) -> varianti del DNA di piccole
dimensioni (< 1-10 Kb)
Nuove tecnologie hanno recentemente permesso di individuare varianti del
DNA di dimensioni intermedie:
Varianti strutturali submicroscopiche
•Copy Number Variants (CNVs) (inserzioni, duplicazioni, delezioni)
•Inversioni
ARRAY CGH (Comparative Genome Hybridization)
Rivela le differenze tra 2 genomi
Arrays: BAC
Oligonucleotidi (60-100 bp)
ROMA (representational oligonuclotide microarray analysis)
Affymetrix SNP arrays
AGTGGGTCGAGCTGATCGATCGGTCG Allele A
AGTGGGTCGAGCCGATCGATCGGTCG Allele B
AGTGGGTCGAGCAGATCGATCGGTCG mismatch
AGTGGGTCGAGCGGATCGATCGGTCG mismatch
AB
PM-A
MM-A
PM-B
MM-B
BB
AA
analisi su 270 individui
1400 CNVs 12% (360 Mb) genoma
Effetti delle varianti strutturali sul fenotipo:
• dosaggio genico
• position effect
•285 geni in OMIM morbid map -> overlap con CNVs
•Alta densità di CNVs vicino ai breakpoint di genomic disorders
•Difficoltà nel risolvere le correlazioni genotipo-fenotipo
Database of genomic variants
http://projects.tcag.ca/variation