Unisessualità e deriva
molecolare: diversità della
sequenza Bag320 in Bacillus
Chiara Barbieri
Il DNA satellite

componente principale del corredo
genetico non sintetizzante
– C-value paradox

coinvolto in molti processi e funzioni
– struttura e dinamica dei centromeri
– evoluzione del cariotipo
– transcriptasi sesso/tessuto-specifica
Evoluzione Concertata


Omogeneizzazione delle nuove varianti con
meccanismi di turnover genomico
Fissazione per redistribuzione dei cromosomi
in nuove combinazioni con la riproduzione
sessuale
– opera distintivamente da selezione naturale e
deriva genetica
– diffondersi di nuove varianti all’interno delle famiglie
ripetute
– fissazione come conseguenza della ridistribuzione
cromosomica in nuove combinazioni
Bag320

DNA satellite che presenta una variabilità tipica
del pattern dell’evoluzione concertata.
• Il genere Bacillus condivide la stessa famiglia satellitare
pericentrometrica Bag320 e mostra una ampia gamma di
meccanismi riproduttivi.

La variabilità di Bag320 è stata analizzata in differenti
popolazioni di B. grandii, B. atticus, B. whitei, B.
lynceorum (906 sequenze analizzate), per esaminare il
contributo del meccanismo di turnover genomico e
delle differenti strategie riproduttive alla variabilità dei
satelliti.
Il genere Bacillus

Bisessuali:
– B. rossius partenogenetico facoltativo.
Mediterraneo ovest.
– B. grandii strettamente bisessuale. Endemico
area siciliana.
• B.grandii grandii popolazioni relitte sud-est
• B.grandii benazzii stretta cintura nel nordest e isola di
Levanzo
• B.grandii maretimi isola di Marettimo, Egadi.

Unisessuali:
– B.atticus automittico partenogenetico
• B. atticus atticus diploide, molto distribuito
• B. atticus carius popolazioni triploidi in Grecia e Turchia
e una popolazione diploide turca.
• B. atticus cyprius diploide, a Cipro


IBRIDI:
3 ibridi telitochi:
– B. whitei (rossius+grandii grandii) apomittico
diploide
– B. lynceorum (rossius+grandii grandii+atticus)
apomittico triploide
– B. rossius-grandii, ramo
ibridogenetico/androgenetico.
MATERIALI E METODI

Campionamento
– Raccolti da 3 a 6 esemplari per popolazione
– mantenuti in laboratorio in gabbie areate con
piante fresche per cibo
– corpi congelati e mantenuti a -80° C per
conservarli per ricerche allozimatiche e molecolari

Caratterizzazione allozimatica degli
unisessuali
– Analisi elettroforetiche sui campioni di sole
femmine che rappresentano diversi biotipi,
ricercando enzimi caratterizzati da polimorfismo.

Analisi mitocondriale degli unisessuali
– Il gene COII è stato amplificato con PCR da
singoli esemplari
– Mutazioni puntiformi sono state prese come
indicative di differenti aplotipi
Analisi del monomero Bag320

Dal DNA genomico preparato da singoli esemplari.
Specifici enzimi di restrizione.
– Monomeri di circa 320 bp estratti da gel di agarosio, legati al plasmide
vettore, usati per ottenere cellule di E. coli competenti. Cloni ricombinanti
identificati con il sistema bianco-blu del gene ßgalattosidasi.
• sequenziati direttamente
• sequenze allineate con algoritmo Clustal del programma Sequence
Navigator

Ottengo 10 sequenze per ogni campione di B.grandii, B.
atticus e B. whitei
– B. Lynceorum condivide sequenze di origine grandii, atticus
e rossius

STATISTICA
– Distanza percentuale media valutata con Mega2.1
– Analisi della varianza a una via
– Tutti i livelli di confronto: intrafemmine, intrapopolazione,
interpopolazione, intersottospecie e interspecie
• Le sequenze di Lynceorum sono state analizzate per eventi di
conversione genica con DnaSP version 3
Risultati

Caratterizzazione genetica degli
unisessuali (analisi mitocondriali e
allozimatiche)

Le 5 popolazioni di atticus studiate hanno mostrato 2
situazioni opposte.
• lo stesso aplotipo mitocondriale ma struttura
allozimica composta
• stessa struttura genetica allozimatica ma
differenti aplotipi mitocondriali

Le popolazioni unisessuali utilizzate per
l’analisi satellitare sono decisamente
eterogenee da un punto di vista genetico
Variabilità Bag320
– Lunghezza media: 314,1 bp (grandii maretimi, atticus) fino 315,7 bp
(grandii grandii)
– variazioni di lunghezza notevoli da rimozioni random
– In B. lynceorum 20 sequenze -grandii e 4 -atticus
mostrano tratti convertiti che derivano dall’altro
subset.
CONFRONTO INTRASPECIFICO
 B. grandii
• B. grandii grandii e B. grandii benazzi: diversità di
sequenze omogenea sia tra che entro gli individui (in
particolare B. grandii grandii)
• B grandi maretimi ha variabilità maggiore
– Il confronto tra le sottospecie mostra valori di
variabilità significativi

B. atticus e B. whitei
– Nessuna differenza significativa tra la
diversità delle sequenze, a tutti i livelli di
confronto

B. lynceorum
– Anche suddividendo la variabilità nelle due
componenti -atticus e -grandii non riscontro
differenze significative
CONFRONTO INTERSPECIFICO

B. grandii VS B. atticus
– B. grandii ha valori di diversità sequenza
significativamente più bassi
• Anche considerando B. grandii grandii, che dovrebbe essere più
affine a B. atticus

B. grandii grandii VS B. whitei
– Stesso livello di diversità sequenza

B. grandii grandii VS B. lynceorum
– Differenze significative (come ci si aspetta per l’origine
triibrida di B. lynceorum)
• La diversità di sequenze non è significativa
considerando il confronto con la componente -grandii

B. atticus VS B. lynceorum
– Stesso pattern di diversità, con la componente -atticus
Discussione


Il bisessuale B. grandii mostra un pattern tipico di
evoluzione concertata: maggiore omogeneità
all’interno del pool della sottospecie.
Gli unisessuali mostrano la stessa variabilità ad ogni
livello di confronto considerato
– indipendentemente da meccanismo partenogenetico (auto o
apomittico) o origine (ibrida o non)
– la variabilità assoluta è particolarmente alta in B. atticus e nelle
sequenze -atticus degli ibridi

Conferma ipotesi Dover (1986): la bisessualità agisce
come forza di deriva nella fissazione delle sequenze
ripetute, uniformando intra e creando discontinuità
inter.
B. grandii maretimi
 Ripetizioni molto divergenti in due individui
– nuove varianti si stanno diffondendo nella
popolazione.
fase mutazionale che conduce a una più
bassa omogeneizzazione di varianti di
sequenze preesistenti.
 Incipiente stadio di speciazione

B. atticus


forse nell’assenza di anfimissi si ha mancanza di
fissazione delle varianti.
– Assenza di omogeneizzazione sequenze tra
individui  partenogenesi rallenta i processi di
turnover molecolare.
Datazione mitocondriale: l’antenato di B grandii grandii
e B. atticus era contemporaneo dell’antenato comune al
gruppo B. grandii, e i monomeri satellitari si sono
allontanati in maniera uguale in questo periodo
– contraddice ipotesi del rallentamento
– suggerisce un’evoluzione confrontabile delle
sequenze satellitari

B. atticus ha una diversità di sequenze molto più alta
di B. grandii grandii, più alta di tutto il gruppo grandii
– bisessualità porta una dinamica di fissazione e
omogeneizzazione entro a tasso maggiore
– limitata distribuzione spaziale di grandii grandii
• taxon relitto, che nel passato aveva un areale più ampio

Le analisi su B. rossius (bisessuale ampiamente distribuito
nel mediterraneo) indicano un’alta variabilità.
 La scarsa variabilità di grandii quindi deriva più dalla sua
storia evolutiva che dal tipo di riproduzione.

Grande omogeneità di sequenze di grandii come
conseguenza del suo più alto numero di copie.
– Meno copie, più eterogeneità in atticus

Collegamento con il numero e l’attività dei trasposoni,
evoluzione concertata del DNA ripetuto in tandem, e tipo di
riproduzione.
B. whitei

omogeneità di sequenza a tutti i livelli di confronto
– Stessa variabilità riscontrata nell’attuale B. grandii grandii

Mancanza di nuova fissazione delle varianti nella
riproduzione clonale e limitato effetto di meccanismi di
turnover genomico

origine ibrida: da pochi incroci tra femmine rossius e
maschi grandii grandii
– All’epoca la variabilità di B. grandii grandii probabilmente si era già
ridotta ai valori attuali

Confronto con B. atticus: assenza di correlazione tra
partenogenesi e livello di variabilità dei satelliti (whitei
ha valori bassi, atticus alti).
– La riproduzione rispecchia la struttura della variabilità
esistente in partenza.
B. lynceorum
– origine contemporanea a B. whitei.


Riflette il livello di variabilità dei genitori nelle
sequenze tipo-atticus e tipo-grandii.
Confermata l’esistenza di sequenze con tratti
convertiti
– La conversione genica è squilibrata: questo
squilibrio col tempo può portare a
omogeneizzazione intra.
• tendenza alla speciazione e stabilizzazione di
genomi allopoliploidi.
– Plasticità mitotica dei tandem repeats
Conclusione


Gli unisessuali sono lontani dall’essere
geneticamente uniformi, qualunque sia il
tempo e l’estensione dei processi molecolari
in un organismo partenogenetico.
Dietro i generali processi molecolari, tratti
specifici dell’organismo sono profondamente
coinvolti nella dinamica del DNA satellitare.