Caratteristiche microbiologiche, patogenetiche
ed epidemiologiche di Legionella spp.
Paola Borella
Dipartimento di Scienze di Sanità Pubblica
Università degli Studi di Modena e Reggio E.
e-mail: [email protected]
Giornata di studio “LA LEGIONELLOSI NELLE STRUTTURE OSPEDALIERE E
TURISTICO-ALBERGHIERE” Perugia, 29 ottobre 2005
Aula Magna della Facoltà di Agraria, Università degli Studi di Perugia
Dipartimento di Scienze di Sanità Pubblica
La storia
Nell’estate del 1976 a Philadelphia si verificò
un’epidemia di polmonite tra i partecipanti ad una
riunione dell’American Legion: tra i 4.000 veterani
del Vietnam presenti ( “Legionnaires”), 221 si
ammalarono e 34 morirono
scoperta di un “nuovo” batterio
denominato Legionella
Classificazione
Famiglia: Legionellaceae
Genere: Legionella
Specie: Legionella pneumophila e
altre 47 specie
Specie e sierogruppi di Legionella
1. L. pneumophila
2. L. bozemanii
3. L. dumoffii
4. L. micdadei
5. L. longbeachae
6. L. jordanis
7. L. wadsworthii
8. L. hackeliae
9. L. feeleii
10. L.maceachernii
11. L.birminghamensis
12. L.cincinnatiensis
13. L.gormanii
14. L.sainthelensi
15. L.tucsonensis
16. L. anisa
17. L. lansingensis
18. L. erythra
19. L. parisiensis
20. L. oakridgensis
21. L. spiritensis
22. L. jamestowniensis
23. L. santicrucis
24. L. cherrii
15
2
1
1
2
1
1
2
2
1
1
1
1
2
1
1
1
2
1
1
2
1
1
1
25. L. steigerwaltii
26. L. rubrilucens
27. L. israelensis
28. L. quinlivanii
29. L. brunensis
30. L. moravica
31. L. gratiana
32. L. adelaidensis
33. L. fairfieldensis
34. L. shakespearei
35. L. waltersii
36. L. genomospecies
37. L. quateirensis
38. L. worsleiensis
39. L. geestiana
40. L. natarum
41. L. londoniensis
42. L. taurinensis
43. L. lytica
44. L. drozanskii
45. L. rowbothamii
46. L. fallonii
47. L. gresilensis
48. L. beliardensis
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Fields BS. Legionella and Legionnaires’ disease: 25 years of investigation. Clin Microbiol Rev 2002;15(3):506-26.
Victor L. Yu et al. Distribution of Legionella species and serogroups isolated by
culture in patients with sporadic community-acquired legionellosis: an
international collaborative survey. J Infect Dis. 2002 Jul 1;186(1):127-8.
This international collaborative survey
identified culture-confirmed legionellosis
in 508 patients with sporadic communityacquired legionellosis.
Legionella pneumophila constituted 91.5%
of the isolates.
Serogroup 1 was the predominant
serogroup (84.2%), and serogroups 2–13
(7.4%) accounted for the remaining
serogroups.
The Legionella species most commonly
isolated were L. longbeachae (3.9%) and
L. bozemanii (2.4%), followed by L.
micdadei, L.dumoffii, L. feeleii, L.
wadsworthii, and L. anisa (2.2%
combined).
L. longbeachae constituted 30.4% of the
community-acquired Legionella isolates in
Australia and New Zealand.
Caratteristiche morfologiche e tintoriali
• Microrganismi di forma bastoncellare
o coccobacillare (osservazione prelievi
clinici)
• Dimensioni di 0,3-0,9 m x 2-4 m
(forme filamentose di 20 m e oltre in
coltura)
• Non sporigeni, non capsulati
• Gram-negativi, si colorano
debolmente in rosso con safranina
• Immobili o mobili per
mezzo di un flagello polare
• Possiedono fimbrie
Caratteristiche di crescita
Temperatura di crescita
Legionella si moltiplica tra 25°C e 42°C con temperatura
ottimale di 35°C
PH di crescita
Il pH ottimale di crescita è leggermente acido ( tra 6,85 e 6,95 ),
ma è tollerato un pH sino a 5,5
Respirazione
Sono batteri aerobi, ma la loro crescita in terreni artificiali è
favorita dalla microaerofilia ( presenza del 2,5% di CO2 )
soprattutto nel primo isolamento
Esigenze nutritive
• Le esigenze nutritive sono soddisfatte dal citoplasma
dei protozoi all’interno dei quali si riproducono alle
adatte temperature
• Per la loro moltiplicazione in terreni sintetici richiedono
vari fattori di crescita: ferro organico, cisteina e fattori
presenti nell’estratto di lievito
Caratteri biochimici
Tabella - Caratteristiche delle specie di Legionella
________________________________________________________________________________________________
Crescita su
Catalasi
BCYE Agar-sangue
Ossidasi
Riduzione
di NO3
Ureasi
Acidificazione
del glucosio
Gelatinasi
-lattamasi
________________________________________________________________________________________________
L.pneumophila +
+
+
+
+
L.micdadei
+
+
+
+
+
L.bozemanii
+
+
+
+/L.dumoffii
+
+
+
+
L.gormanii
+
+
+
+
+
L.longbeachae +
+
+
+
+
L.wadsworthii +
+
+
+
____________________________________________________________________________________________________________________
In terreni artificiali, le legionelle sono biochimicamente poco attive.
Terreni zuccherati: non acidificati
Urea: non idrolizzata
Nitrati: non ridotti
Gelatina: idrolizzata (tranne L. feeleii )
Ambiente naturale
Le legionelle sono batteri dell’ambiente
naturale acquatico. Sono presenti in:
- Fiumi
- Laghi
- Stagni
- Raccolte d’acqua
superficiali di qualsiasi
entità
- Suolo umido
La concentrazione delle legionelle nell’ambiente è usualmente bassa
Legionella sopravvive negli ambienti acquatici come
parassita intracellulare di protozoi a vita libera
La scoperta del ruolo dei protozoi
(14 specie di amebe, tra cui
Naegleria e Acanthamaebae, due
specie
di
flagellati
tra cui
Tetrahymena ed una specie di
muffa gelatinosa) come serbatoio
per la moltiplicazione e la
sopravvivenza delle legionelle ha
permesso
di
comprendere
l’epidemiologia e l’ecologia di
questi batteri.
A 20 °C, i protozoi fagocitano le
legionelle e le digeriscono in gran
numero.
A 35°C, le legionelle fagocitate
si moltiplicano all’interno dei
protozoi.
Ciclo vitale di L. pneumophila









Vita libera: batteri flagellati e mobili
Aderenza alle cellule ospiti: protozoi o macrofagi
Ingestione da parte della cellula ospite
Perdita del flagello nel citoplasma
Occupazione di un vacuolo e formazione di un unico fagosoma
che non si fonde con il lisosoma
Il fagosoma si trasforma in un comparto con reticolo similendoplasmatico
Fase replicativa: i batteri non ciliati si moltiplicano nel reticolo
simil-endoplasmatico del fagosoma
Fase infettiva: il fagosoma si fonde con il lisosoma e libera batteri
ciliati ed attivamente mobili
la cellula ospite muore ( i protozoi per necrosi, i macrofagi e le
cellule alveolari per apoptosi o per necrosi).
• Le legionelle, di per se stesse, sono poco
resistenti agli agenti fisici e chimici
• All’interno dei protozoi, e soprattutto
all’interno delle cisti, sono molto resistenti
agli aumenti di temperatura e ai biocidi
• Nell’ambiente sopravvivono per molti mesi
se sono all’interno dei protozoi
Ambiente urbano
- Rete di distribuzione dell’acqua
-Sistemi di condizionamento e umidificatori
(torri di raffreddamento/condensatori
evaporativi)
- Fontane decorative, impianti termali, vasche
per idromassaggi, bagni turchi e aree adibite
a sauna, sistemi di irrigazione, acque di
scarico di impianti igienici
- Piscine e cisterne con acqua stagnante
- Apparecchiature per inalazioni
Gli ambienti idrici artificiali agiscono da amplificatori e disseminatori
Modalità di contaminazione
• Poche cellule microbiche entrano negli
impianti e si riproducono (20-45°C)

RUOLO ESSENZIALE DELL’ACQUA CALDA
Fattori favorenti la colonizzazione
di ambienti idrici artificiali
temperatura dell’acqua
fenomeni di ristagno/ostruzione
incrostazioni
torbidità, sostanze organiche, biofilm, Zn
materiali (guarnizioni di gomma)
presenza di alghe e amebe acquatiche
Altri fattori sospetti
durezza dell’acqua
altri germi e materiali biodegradabili
situazione climatica
vibrazioni/cambiamenti di pressione nel sistema idrico
Biofilm
Un biofilm è costituito da
aggregati di batteri, protozoi
e miceti che aderiscono a
irregolarità
delle
pareti
interne di condutture ed
altre strutture a contatto con
l’acqua, formando delle
stratificazioni che hanno
l’effetto di corrodere le
pareti stesse, facilitando
depositi ed incrostazioni che
sporgono e tendono ad
occludere le tubazioni
Biofilm
La presenza del biofilm è
essenziale
per
la
colonizzazione da parte
delle
legionelle,
che
trovano in esso i protozoi
entro cui moltiplicarsi e
svolgere il loro ciclo vitale
Fattori di rischio aggiuntivi nelle strutture
turistiche
Particolarità delle strutture turistiche
- sistema di distribuzione dell’acqua molto complesso (ogni
stanza ha il bagno) con percorsi lunghi dal sito di
distribuzione ai rubinetti
- soggiorni brevi, variabilità nell’uso in base alla stagione:
- in alta stagione consumo di acqua concentrato in certe ore
del giorno e notte (calo della T° dell’acqua)
- in bassa stagione, scarso consumo o albergo chiuso con
possibile ristagno che facilita la formazione di biofilm
la qualità dell’acqua erogata può variare e dovrebbe essere
monitorata più frequentemente
-scarsa conoscenza del problema da parte del personale
dei servizi tecnici dell’hotel
Letteratura
Letteratura
Ruolo della flora batterica acquatica
nell’ecologia microbica di L. pneumophila
INTERAZIONI
DIRETTE
competizione e
produzione di
batteriocine
INDIRETTE
interazioni con i
protozoi
Screening su 72 ceppi di
Pseudomonadaceae:
Nei confronti dei protozoi
batteri possono:
64%
PRODUTTORI
DI
BATTERIOCINE
attive
contro L. pneumophila
Fungere da nutrimento
 favorire le legionelle
Parassitarli  sfavorire
le legionelle
Messi P, Guerrieri E, Bondi M, Borella P. Interferenza microbica: quale ruolo nell’ecologia di
Acanthamoeba polyphaga e Legionella pneumophila? Atti del 41° Congresso Nazionale SItI “Obiettivo salute:
l’evoluzione cultuale in Europa” Genova, 20-23 ottobre 2004.
Interferenza microbica e sviluppo di
biofilm in vitro
10000000
1000000
ufc/cm2
100000
10000
1000
L.p.
L.p. + Pseudomonas aeruginosa
L.p. + Pseudomonas fluorescens
L.p. + Acinetobacter lwoffii
100
10
1
0
3
6
Tempo (giorni)
9
12
P. aeruginosa  produce PIOCINE ma non influisce su L.p.
P. fluorescens  produce una BATTERIOCINA e inibisce L.p.
A. lwoffii  non produce alcuna sostanza e promuove L.p.
Messi P, Bondi M, Marchesi I, Borella P, Guerrieri E. “Role of direct bacterial interference and biofilm in
Legionella pneumophila water ecology” Atti del 20th Annual Meeting of EWGLI, 2005
Modalità di infezione
Per inalazione di aerosol
contaminati
Per aspirazione di acqua
contaminata
Per inalazione di particelle di polvere
da essi derivate per essiccamento
Non si contrae bevendo acqua
contaminata
La trasmissione interumana non è stata dimostrata
Modalità di infezione
La legionellosi si contrae generalmente via
respiratoria mediante inalazione o
microaspirazione di aerosol contaminato
L’aerosol si forma attraverso le goccioline
generate dagli spruzzi d’acqua o dall’impatto
dell’acqua sulle superfici
Più le goccioline sono piccole (< 5 micron) più
facilmente raggiungono le basse vie respiratorie
Fattori di rischio per l’infezione
•ESPOSIZIONE: tipo e intensità: carica batterica,
grado di aerosolizzazione dell’acqua, vicinanza alla
sorgente di aerosol
•VIRULENZA DEL CEPPO: diversa capacità di
sopravvivere e moltiplicarsi nei serbatoi ambientali
ed umani (macrofagi)
•SUSCETTIBILITA’ INDIVIDUALE: anziani, fumatori,
soggetti con malattie croniche,
immunocompromessi e con prolungata degenza
ospedaliera
Fattori di rischio per infezione
500
numero
400
300
Femmine
200
Maschi
100
0
<20 20- 30- 40- 50- 60- 70- 8029
39
49
59
69
79
89
classi di età
Sesso
M:F = 2-3:1
Età media =55 aa, il 60% dei pazienti ha più di 50 aa
Rara nei bambini, poco frequente nei giovani adulti
Il 40% dei soggetti ha patologie croniche concomitanti
Rapporto infetti/malati
Essendo un microrganismo opportunista, la
maggior parte degli individui sani supera
l’infezione senza manifestare sintomi di
malattia conclamata, ma i meccanismi di
protezione e/o suscettibilità non sono
conosciuti
Origine dei casi

I primi casi di legionellosi sono stati ricondotti ad
aerosol provenienti da impianti di climatizzazione

Le infezioni più recenti sono state causate da
contaminazione di:
impianti di distribuzione dell’acqua (docce,
rubinetti, fontane, impianti termali, idromassaggi)
apparecchi per aerosol, ossigenoterapia e per la
respirazione assistita
–
–
–

Numerosi clusters epidemici vengono segnalati per la
diffusione di aerosol contaminati da torri di
raffreddamento di grandi edifici

Segnalati

Segnalato un caso in un bambino a seguito del parto in
acqua
casi acquisiti attraverso ferite
I quadri clinici
La Malattia dei Legionari è la forma più
severa dell’infezione
Si presenta come una polmonite acuta
purulenta difficilmente distinguibile da altre
forme di infezioni respiratorie acute delle
basse vie aeree
La Febbre di Pontiac è una
manifestazione acuta simil-influenzale
che non interessa il polmone
Malattia dei Legionari
•Incubazione da 2 a 10 giorni (forse fino a 15gg)
•Prodromi (malessere, mialgie e cefalea) cui segue
febbre alta, tosse non produttiva, sintomi comuni ad
altre forme di polmonite
•Possono essere presenti sintomi extrapolmonari utili
ad indirizzare la diagnosi, quali manifestazioni
neurologiche, renali e digestive
•Il reperto radiologico toracico non è patognomonico
•La diagnosi definitiva può essere raggiunta
solo con indagini di laboratorio
DIAGNOSI
Isolamento colturale (escreato, sangue, BAL,
tessuti post-mortem) con terreni di coltura
selettivi e tempi di crescita lunghi (4-10 giorni)
Ricerca dell’antigene solubile nelle urine di L.
pneumophila sierogruppi 1-14
Sieroconversione (almeno 10gg)
Immunofluorescenza diretta
PCR
Alcune osservazioni
L’aumentata
consapevolezza
della
malattia fra i medici e l’uso dei test per la
ricerca
dell’antigene
urinario
ha
incrementato la individuazione dei casi
sostenuti da L.pneumophila
Il gold standard resta tuttavia
l’isolamento colturale che consente:
a) di riconoscere tutte le infezioni
b) di risalire alle fonti ambientali,
attraverso l’analisi molecolare dei ceppi
clinici ed ambientali isolati
Terapia
I macrolidi quali claritromicina e azitromicina o i
fluorchinolonici (levofloxacina) sono i farmaci più idonei per
la loro capacità di concentrarsi nei macrofagi e nei tessuti
polmonari
La loro associazione è particolarmente utile nei pazienti
fortemente immunocompromessi
La terapia deve essere prolungata per almeno 3 settimane
Antibiotico resistenza
Antibiotici quali la eritromicina, fluorchinolonici e rifampicina
possono non risolvere la malattia, ma non sono segnalati
fenomeni di resistenza negli isolati clinici di L. pneumophila.
Dalle indagini sperimentali tutti i ceppi saggiati (ambientali e
clinici) sono risultati sensibili ai farmaci di elezione.
La mancanza della fase di colonizzazione prima dell’infezione
(manca il portatore) minimizza il rischio di resistenza alle
Legionellaceae in ambiente ospedaliero.
Manca la pressione selettiva nell’ambiente naturale del
microrganismo che è rappresentato dall’acqua contaminata.
La possibilità di comparsa di resistenze suggerisce tuttavia di
testare la sensibilità delle legionelle agli antibiotici che si
intendono utilizzare per la terapia.
Altre forme di legionellosi
• Febbre di Pontiac
La Febbre di Pontiac è una manifestazione acuta similinfluenzale che si risolve in 2-5 giorni, con tosse nel 30-60%
dei casi e dolore toracico in assenza di interessamento
polmonare. Si pensa sia dovuta ad una reazione ad antigeni
batterici inalati, piuttosto che ad una vera e propria infezione.
Incubazione 24-48 ore
• Forme subcliniche
Il frequente riscontro di anticorpi anti-Legionella spp ( 15%
nella popolazione generale, dati personali) in assenza di
episodi di polmonite fa ritenere che la legionellosi si possa
manifestare come forma subclinica
Definizione di caso
Caso accertato
infezione respiratoria con E.O. positivo per
polmonite focale e/o esame radiologico
suggestivo di interessamento
polmonare,accompagnato da 1 o più dei seguenti
criteri:
• isolamento di Legionella da materiale organico
(secrezioni, tessuto polmonare, liquido pleurico o
sangue)
• aumento di almeno 4 volte del titolo anticorpale
verso L. pneumophila sierogruppo 1 tra 2 sieri
prelevati a distanza di almeno 10 giorni
• riconoscimento dell’antigene specifico solubile nelle
urine
Definizione di caso
Caso presunto
infezione respiratoria con E.O. positivo per
polmonite focale e/o esame radiologico
suggestivo di interessamento polmonare,
accompagnato da 1 o più dei seguenti criteri:
• aumento di almeno 4 volte del titolo anticorpale
relativo a sierogruppi o specie diverse da L.
pneumophila sierogruppo 1
• positività all’immunofluorescenza diretta effettuata
su materiale patologico
• singolo titolo anticorpale elevato (1:256) verso L.
pneumophila sierogruppo 1
Definizione di Caso nosocomiale
Caso confermato da test di laboratorio, in cui il
paziente è stato ricoverato continuativamente
in ospedale per almeno 10 giorni prima
dell’esordio della malattia
Se il periodo di ospedalizzazione è compreso
fra 2 e 9 giorni, il caso è considerato di
possibile eziologia nosocomiale
Se 2 o più casi si verificano nello stesso
ospedale nell’arco di 6 mesi, vengono
considerati una epidemia ospedaliera
Linee Guida nazionali
Classificazione dei casi
1 - Casi nosocomiali
• 1999 Europa 9%
• 2004 Italia 16,0%
Rappresentano una % limitata dei casi notificati, ma hanno
letalità più elevata (circa 22-30% vs 10% nei casi comunitari)
2 - Casi associati ai viaggi
• 1999 Europa 21% (15% associati a viaggi all’estero)
• 2004 Italia 13,6%
3 - Altri Casi comunitari
• 1999 Europa 70%
• 2004 Italia 70,4%
Per la maggior parte di questi non è possibile risalire alla
sorgente di infezione
Caratteristiche epidemiologiche delle legionellosi
L’incidenza reale delle legionellosi nella
popolazione è sconosciuta:
nonostante l’aumento delle segnalazioni, l’incidenza
dei casi notificati resta bassa
Casi attesi (stima):
1-5% di tutti i casi di polmoniti comunitarie
3-20% di tutte le polmoniti nosocomiali
Sulla base di queste indicazioni in Italia i casi
incidenti potrebbero essere
1.000-10.000/anno
Motivi della sottostima
la diagnosi etiologica delle polmoniti
non è generalmente richiesta
la diagnosi di legionellosi richiede
test specifici non effettuati di routine
i medici non sono sempre allertati
Motivi di preoccupazione
Aumento nella popolazione delle persone a
rischio
Aumento negli ospedali di pazienti e
procedure a rischio
Difficoltà ad eradicare Legionella dai
serbatoi contaminati
Mancanza di metodi ottimali per prevenire
la legionellosi
Aspetti critici della legionellosi
A) difficoltà nella identificazione dei casi e nella
ricerca delle fonti ambientali
B) insufficiente conoscenza sulla reale prevalenza
della infezione/malattia
C) poche informazioni sui fattori di rischio
coinvolti nella infezione/malattia e nessuna sulla
predisposizione genetica
D) limitate conoscenze sugli eventi molecolari e
biochimici che permettono la
sopravvivenza/moltiplicazione di Legionella nelle
cellule umane e nei reservoirs ambientali
E) difficoltà a controllare/eradicare Legionella
spp applicando metodi di disinfezione efficaci