Nella SDS-PAGE la velocità di migrazione è
proporzionale alle dimensioni della proteina
(il rapporto CARICA/MASSA è uguale per tutte le proteine)
-
+
Dopo aver tolto la corrente, il gel è rimosso dalle due lastre di vetro e
messo a colorare in una soluzione colorante adatta, in agitazione
Si tratta di un colorante strettamente correlato a quello utilizzato nel test di
Bradford per la determinazione della concentrazione proteica
Le bande proteiche sono fissate e la maggior parte del sodio dodecil solfato
è rimosso immergendo il gel in una soluzione che contiene acido acetico
diluito e metanolo
Il gel è poi immerso in una soluzione che contiene Coomassie Brilliant Blue
R-250 sciolto in acido acetico diluito e metanolo
Spesso si ottengono risultati accettabili fissando e colorando simultaneamente
in una singola soluzione che contiene il colorante
Per ottenere bande proteiche omogenee generalmente si colora il gel fino a
quando non è uniformemente blu
A tal punto si rimuove il colorante che non è adeso alle proteine immergendo il
gel in una soluzione di acido acetico diluito e metanolo
Il gel colorato può essere
posto tra due fogli
di cellophane e fatto
asciugare in un essiccatore
per gel che fornisce
vuoto e calore
Il gel è immerso in una soluzione diluita di metanolo per fissare le
proteine al gel
Il gel è incubato con una soluzione acida di nitrato di argento che
reagisce con siti delle proteine
Un’immagine si forma per riduzione dell’argento ionico alla forma
metallica per opera della formaldeide a pH alcalino (sodio
carbonato)
Lo sviluppo è fermato acidificando la soluzione con acido acetico
In media il metodo è da 10 a 100 volte più sensibile della
colorazione con Coomassie Brilliant Blue R-250
Si tratta di un gel di poliacrilammide nel quale la percentuale di
acrilammide varia in modo uniforme dal 5% (alla sommità del
gel) al 25% (sul fondo dello stesso).
Il gradiente è formato con un formatore di gradiente.
I gel in gradiente sono generalmente preparati con SDS e con
uno stacking gel.
Ci sono due vantaggi ad utilizzare i gel in gradiente:
1. E’ possibile separare proteine con un intervallo di massa
molecolare relativa molto più ampio rispetto ad un gel a
porosità costante
2. Proteine con masse molecolari relative simili possono essere
separate
Analisi quantitativa delle proteine presenti nel campione di interesse
Determinazione del peso molecolare di proteine sconosciute
Analisi qualitativa delle proteine presenti nel campione di interesse
(colorazione con Coomassie Brilliant Blue R-250 o western-blotting)
Per seguire il corso della purificazione di proteine per cui non esiste un
saggio enzimatico conveniente
Per visualizzare i contaminanti nel corso di una procedura di
purificazione
La presenza di proteine contaminanti con un peso molecolare simile a
quello della proteina di interesse non è di solito un problema poiché il
potere di risoluzione della tecnica è tale da consentire di distinguere
differenze di massa molecolare dell’1%
Se la proteina di interesse è composta da più subunità, il rapporto tra
subunità diverse deve rimanere costante durante il processo di
purificazione
10 μg di proteine totali del campione da:
Proteina di interesse
1.
2.
3.
4.
5.
STD
Omogenato 5 µl
I purif. 10 µl
II purif. 15 µl
III purif. 20 µl
0,5µg
2,5 µg
La densitometria a scansione si basa
sulla misura della luce trasmessa
quando il raggio laser è fatto passare
attraverso il gel.
LogPM (Da)
Identificazione del PM di una proteina sconosciuta
Mobilità relativa (mm)
Al termine della corsa elettroforetica le proteine sono trasferita su un filtro
di nitrocellulosa mediante una procedura definita elettroblotting
Il gel e la nitrocellulosa sono posti in un apposito cestello a forma di
sandwich immerso in un tampone nel quale ci sono due elettrodi paralleli
La corrente, in direzione perpendicolare al gel, trasferisce, con un processo
elettroforetico vero e proprio, le proteine sul foglio di nitrocellulosa
Il foglio di nitrocellulosa, sul quale sono state trasferite le proteine, è
chiamato blot
Il blot è incubato in una soluzione proteica, ad esempio albumina di siero
bovino al 5%, o, in alternativa, latte in polvere privo di grassi al 5%, in
modo da bloccare tutti i siti di interazione idrofobica disponibili sul foglio
di nitrocellulosa
Il blot è incubato in una soluzione contenente un anticorpo diretto contro
la proteina di interesse
Il blot è poi ulteriormente incubato in una soluzione contenente anticorpi
secondari, in grado, cioè, di riconoscere la porzione costante della
molecola di IgG utilizzata come anticorpo primario
Generalmente si utilizzano anticorpi secondari coniugati ad un enzima
In tal caso, dopo il trattamento con l’anticorpo secondario, il blot è
incubato in una soluzione contenente il substrato dell’enzima che, per via
enzimatica, è convertito in un prodotto colorato che precipita sulla
nitrocellulosa
Come enzima coniugato è spesso adoperata la
fosfatasi alcalina, enzima che converte
il
5-bromo-4-cloro-indolofosfato
(BCIP)
incolore in un prodotto di colore blu,
oppure la perossidasi di rafano che,
utilizzando acqua ossigenata come substrato,
ossida il 3-ammino-9-etilcarbazolo in un
prodotto insolubile marrone o il 4-cloro-1naftolo in un prodotto insolubile blu.
Enhanced chemiluminescence: in presenza di
acqua ossigenata e di luminolo, un substrato
chemiluminescente, la perossidasi ossida il
luminolo con concomitante produzione di
luce, la cui intensità aumenta di 1.000
volte in presenza di un intensificatore
chimico. La luce emessa può essere rilevata
esponendo il blot ad una lastra fotografica.
proteine
Enzima
Purezza
totali
Resa %
U tot.
(mg)
(%)
(mg)
As
(U/mg)
Omogenato
1000
100
100 %
10 %
10000
10
1° step
purificazione
100
50
50 %
50 %
5000
50
2° step
purificazione
27
25
25 %
92 %
2500
92
3° step
purificazione
20
19.8
19.8 %
99 %
1980
99
Saggio
Stima da
colorimetrico SDS-PAGE
Saggio d’attività
Quasi tutte le informazioni necessarie sono disponibili:
 Bibliografia: http://www.pubmed.org
 Struttura proteine: http://www.rcsb.org
Una proteina, per essere purificata, deve essere dapprima estratta
dalla sua matrice biologica e quindi allontanata selettivamente dalle
altre proteine mediante procedure di frazionamento opportune.
Il processo di omogeneizzazione, disgregando i tessuti, consente
il rilascio dei componenti intracellulari.
Sonicazione
(ultrasuoni)
Presse
Omogeneizzatori
meccanici
Il pestello può essere mosso a mano o da un motore elettrico. Il tessuto è forzato a
passare tra le pareti del tubo di vetro, che è mantenuto fermo, ed il pistone mobile
che ruota.
Il metodo è adatto per tessuti animali e vegetali, ma non per cellule di
microrganismi che sono semplicemente agitate, ma non disgregate dal trattamento.
SONICAZIONE E PRESSE
Sonicazione
Tale metodo si basa sull’utilizzo di
ultrasuoni (10.000-15.000 Hz).
Le pareti cellulari si rompono a causa
delle elevate ondate pressorie, in
grado di sviluppare una forza di
rottura all’interno delle cellule.
French press
E’ l’apparecchio più usato per la
rottura di cellule di microrganismi.
Le cellule scoppiano per l’alta
pressione (108 Pa).
La cella a pressione è formata da una
camera di acciaio inox che si apre
all’esterno per mezzo di una valvola
a spillo.
La centrifugazione differenziale di un omogenato di cellule
eucariotiche consente di separare i componenti cellulari
(frazione nucleare, frazione mitocondriale, citosol…)
Il metodo si basa sulla diversa velocità di sedimentazione di particelle con
differente forma e densità sottoposte ad un campo centrifugo.
Le prime particelle che sedimentano sono quelle di maggiori dimensioni.
Se le particelle hanno la stessa massa, ma densità differente,
sedimenteranno prima quelle a densità maggiore, seguite da quelle di
uguale massa ma densità minore.