CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO
AA 208-09
Adriana Maggi
LEZIONE 10
Ingegneria animale I
ANIMALE TRANSGENICO:
• animale nel cui genoma e’ stato introdotto un
frammento di DNA esogeno
TRANSGENE
• frammento di DNA esogeno integrato
stabilmente nel patrimonio genetico di cellule
animali o vegetali
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE
1 Iniezione di DNA esogeno nella cellula uovo
(TRANSGENESI STANDARD)
2 Ingegneria di cellule staminali in coltura e loro
iniezione in blastocisti (GENE TARGETING)
3 Enucleazione della cellula uovo e inserzione di
un
nucleo
di
una
cellula
somatica
(CLONAZIONE)
TRANSGENESI
STANDARD
Microiniezione
del DNA clonato
zigote
Embrione
stadio 2 cellule
Impianto nella
femmina
pseudogravida
10-20% dei nascituri
contiene il transgene
GENE TARGETING
Trasfezione
del DNA clonato
in cellule ES
Iniezione delle
cellule staminali
nella blastocisti
Impianto della
blastocisti in femmina
pseudogravida
Topo chimerico
Ibrido F1
25-75% della progenie
portano il transgene
CLONAZIONE
Pecore con
muso giallo
Pecore con
muso nero
Oocita
enucleato
Cellula somatica
con nucleo
Trasferimento del
nucleo nell’oocita
Impianto nella pecora
Nascita della pecora
dal muso giallo
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE
Transgenesi standard
SCOPO -GUADAGNO DI FUNZIONEesprimere un gene esogeno (transgene)
in uno o piu’ tessuti dell’animale.
(Eccezionalmente si puo’ avere
perdita di funzione dovuta alla
integrazione del transgene
in una sequenza codificante.)
Preparazione
oociti fecondati
Preparazione
‘pseudo pregnant’
Transgenesi
standard
METODO
nel
dettaglio
microiniezione
Preparazione
costrutti
Screening della
progenie
Preparazione oociti fecondati
Cocktail ormonale
Incrocio
Recupero uova
fecondate
Preparazione del costrutto
Purificazione del transgene
propagazione del transgene
transgene
Vettore di clonaggio
Preparazione delle
‘pseudo pregnant’
Femmina
Maschio
vasectomizzato
Incrocio
Impianto degli oociti microiniettati
Microiniezione e reimpianto
degli oociti microiniettati
Prelievo delle uova
fecondate
Microiniezione
Trasferimento delle uova fecondate
microiniettate con il gene di interesse
nell’utero di femmina pseudogravida
Screening della progenie
Analisi del DNA
estratto dalle code
della progenie per :
PCR
Southern blot
Tecniche utilizzate per la verifica del genotipo
Southern
Blot
Tecniche utilizzate per la verifica del genotipo
Polymerase chain reaction
Ciclo di base
Amplificazione
Incroci per l’omozigosi
Founder/wild type
F1/F1
F2
Omozigoti 1:4
Eterozigoti 1:2
Wild type 1:4
Transgenesi standard - riepilogo procedura -
• microiniezione del transgene negli oociti fecondati
• impianto nella femmina pseudogravida
• gravidanza e nascita dei ‘Founder’
• Screening dei ‘founder’
• incroci successivi per ottenere l’animale omozigote
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE
Transgenesi standard
Destino del DNA dopo la microiniezione
• integrazione stabile nel genoma della linea germinale
dell’animale
• integrazione in singola copia o con maggior frequenza
in copie multiple distribuite secondo un tipico
arrangiamento ‘in tandem’
• integrazione nel genoma in posizione casuale tramite
RICOMBINAZIONE NON OMOLOGA
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE
Gene targeting
SCOPO -PERDITA DI FUNZIONEablare un gene endogeno attraverso
l’inserzione mirata di un transgene
GENE TARGETING
Trasfezione
del DNA clonato
in cellule ES
Iniezione delle
cellule staminali
nella blastocisti
Iniezione delle
cellule staminali
nella blastocisti
Topo chimerico
Ibrido F1
25-75% della progenie
portano il transgene
GENE TARGETING - procedura -
• generazione di cellule staminali (Embryonic Stem cells o
cellule ES)
• preparazione del vettore
• trasfezione delle cellule ES con il vettore
• iniezione delle cellule trasfettate nella blastocisti
• generazione di topi mosaico
• incroci successivi per ottenere l’animale con il transgene nella
linea germinale
Generazione di cellule staminali ES
Blastocisti
Femmine dopo 3-4 giorni
dal concepimento
Espianto e messa in
coltura
Crescita in terreno
selettivo per le ES
Disaggregazione
1 passaggio
Linea pura
Trasfezione delle ES
Trasfezione del vettore (elettroporazione)
Selezione delle
cellule knock out
Cellule ES
Strategia di selezione delle ES knock out
Destino del DNA
Integrazione sito
specifica
Integrazione random
Frequenza: Omologa/non omologa = 1/1000
Ricombinazione omologa
Es. di gene targeting
Verifica del genotipo
Southern blot
PCR
Iniezione delle cellule ES nella blastocisti
- generazione di animali mosaico -
Incroci per l’omozigosi
Founder/wild type
F1/F1
F2
Omozigoti 1:4
Eterozigoti 1:2
Wild type 1:4
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE
Gene targeting
Destino del DNA dopo la microiniezione
• integrazione stabile nel genoma della linea germinale
dell’animale
• integrazione in singola copia
• integrazione nel genoma in un sito specifico tramite
RICOMBINAZIONE OMOLOGA
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE
Clonazione - procedura Il nucleo di cellule somatiche (ghiandola
mammaria) arrestate nella fase G0 del
ciclo cellulare e’ impiantato in un oocita
enucleato nella metafase II della meiosi
CLONAZIONE
Pecore con
muso giallo
Pecore con
muso nero
Oocita
enucleato
Cellula somatica
con nucleo
Trasferimento del
nucleo nell’oocita
Impianto nella pecora
Nascita della pecora
dal muso giallo
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE
Clonazione
SCOPI
• ottenimento di “gemelli” di un fenotipo
di interesse
• nuovo metodo di transgenesi
possibilita’ di ingegnerizzare le cellule
somatiche da cui si preleva il nucleo per
il reimpianto
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE
Riepilogo
• transgenesi standard
- guadagno di funzione
• gene targeting
- perdita di funzione
• clonazione
- generazione clonale
di individui
GENERAZIONE DI MUTANTI CONDIZIONALI
Il sistema cre-loxP
LoxP
Gene bersaglio
CRE RICOMBINASI
LoxP
GENERATION OF THE LID/ERE-Luc MOUSE
LID (liver-specific IGF-I genedeficient)
Esone 4
ERE-Luciferase
Cre
X
Luciferase
Albumin promoter
Lox
P
ERE sequences
X
Ex 4
Luciferase
CRE
80% plasma
IGF-I
LID/ERELuc
APPLICAZIONI FARMACOLOGICHE
DELL’INGEGNERIA ANIMALE
• Studio di funzione genica (ricerca di base)
• Modelli di patologia umana
• Produzione di biofarmaci
• Modelli per lo screening di farmaci
Studi di funzione genica
(ricerca di base)
Es. Knock-out dei recettori per le lipoproteine a bassa
densita’ e implicazione nei meccanismi patogenetici di
insorgenza dell’aterosclerosi
Transgenici per i ligandi dei recettori sopracitati (ApoE e
ApoB) e implicazione nei
meccanismi patogenetici di insorgenza dell’aterosclerosi
Modelli di patologia umana
Utilizzi in farmacologia
• studio dei meccanismi patogenetici e identificazione di
nuovi bersagli farmacologici
• test dell’attivita’ farmacologica di composti
Modelli di patologia umana
• Malattie virali
• Malattie ereditarie
• Malattie neoplastiche
Per approfondimenti Bedell et al.
Genes & Development (1997) 11: p. 11-43
Modelli di malattie virali
virus umani spesso non infettano altri
mammiferi
Si generano modelli transgenici
Es. Papovavirus JC responsabile della
leucoencefalopatia multifocale sviluppo di una
patologia simile nel topo transgenico per il virus
Modelli di malattie ereditarie monogeniche
• Es. Transgeenico per l’huntightina mutata
provoca la malattia di Huntighton nel topo
Goldberg, Y. et al., Absence of disease phenotype and intergenerational stability of the
CAG repeat in transgenic mice expressing the human Huntington disease transcript.
Hum. Molec. Genet. 5: 177-185, 1996. PubMed ID : 8824873
• Es. Knock out per il cluster genico
della beta-globina provoca beta-talassemia
nel topo
Ciavatta, D. J.; Ryan, T. M.; Farmer, S. C.; Townes, T. M. : Mouse model of
human beta-0-thalassemia: targeted deletion of the mouse beta(maj)- and
beta(min)-globin genes in embryonic stem cells.
Proc. Nat. Acad. Sci. 92: 9259-9263, 1995. PubMed ID : 7568113
Modelli di malattie neoplastiche
Es. Mutazioni nel gene che codifica per APC
(ADENOMATOUS POLYPOSIS OF THE COLON)
predispongono ai tumori del colon.
La mutazione introdotta per gene targeting
anche nel topo provocainsorgenza di tumori
intestinali.
Produzione di biofarmaci
Utilizzo di vettori tessuto specifici per
esprimere proteine terapeutiche nel latte
o nel siero di animali transgenici
Modelli per lo screening di farmaci
• Topo Transgenico ERE-Luciferasi
Modello per lo screening di farmaci attivi
sul recettore degli estrogeni.
SCREENING OF COMPOUNDS MODULATING ERs ACTIVITY
CMV
ER cDNA
SERMS
trascrizione
ER
traduzione
Luciferasi
ER
RNA pol
Attivazione
di ER
tra
ER
trascrizione
Co-Fact.
NO trascrizione
ERE
prom.
LUCIFERASI
RNA pol
ER ER
ERE
prom.
LUCIFERASI
Strategia per la generazione del topo reporter ER-luc
INTERESSE FARMACOLOGICO
DEGLI ESTROGENI
• (Malattie neurodegeneragive)
• Terapia endocrina dei tumori
• (Rischi cardiovascolari)
• Controllo della ferilita’
Disfunzioni endocrine
• Prevenzione dell’osteoporosi
LUCIFERASE EXPRESSION IN LIVER AND BONE
TIME
DOSE
250
200
20
10
0
0h
E2
3h
6h
16h
300
fold induction
fold induction
fold induction
250
LIVER
ANTAGONISTS
150
0
E2
200
°
50
25
°
*
0
0 0.5 5 50 250
20
10
E2
0
0h
3h
6h
16h
30
fold induction
30
fold induction
BONE
fold induction
(mg/Kg)
20
10
0
E2
0 0.5 5
50 250
(mg/Kg)
30
20
10
0
*
°
°
IMAGING OF ESTROGENIC ACTIVITY
0h
pharmacological
treatment
with E2
3h
24h
6h
6h
CYCLING FEMALES
400
PROES.
ESTR.
DIEST.
120
LIVER
BONE
80
200
40
0
0
200
300
OVARIES
BRAIN
200
100
100
0
E D-1 D-2 P
P
E
D
Estradiol (pg/ml)
DIEST.-1
E D-1 D-2 P
DIEST-2
PROEST.
ESTRUS
13
13
13
50
25
0
13