Rapporto microorganismi
e
organismi pluricellulari
Steps in successful infection
Steps in successful infection
• Sex comes before disease
– acquire virulence genes
• Sense environment
– and Switch virulence genes on
and off
• Swim to site of infection
• Stick to site of infection
• Scavenge nutrients
– especially iron
• Survive stress
• Stealth
– avoid immune system
• Strike-back
– damage host tissues
• Subvert
– host cell cytoskeletal and
signalling pathways
• Spread
– through cells and organs
• Scatter
Azione patogena dei batteri
• COLONIZZAZIONE e MOLTIPLICAZIONE
nell’OSPITE
–
–
–
–
–
Adesione
Moltiplicazione batterica
Colonizzazione
Invasione tessuti
“Escape”difese
• DANNO OSPITE
– Produzione di tossine
– Produzione di mediatori
flogosi
- Reazioni autoimmunitarie
Bacterial Sex
per acquisire geni di virulenza
• Batteri hanno 3 strategie
per scambiare DNA
– Trasformazione
• cells take up naked DNA
– Trasduzione
• phages carry DNA
– Coniugazione
• cells mate through
specialised appendages
Bacterial Sex
elementi genetici mobili
• Trasposoni
– ST enterotoxin genes
• Plasmidi di Virulenza
– e.g. TTSSs in Shigella,
Yersinia; toxins in
Salmonella, E. coli,
anthrax
• Fattori di virulenza
codificati da fagi
– e.g. botulinum toxins,
diphtheria toxin, shigalike toxin (linked to
lysis), staphylococcal
Bacterial Sex
isole di patogenicità
• Concetto originato da studi su ceppi di E. coli uropatogenici
• Elementi caratterizzanti
– Presenza di (molti) geni di virulenza
– Presenza in ceppi patogeni ma non in ceppi apatogeni
– Differente contenuto in G+C ripsetto al cromosoma dell’ospite
– Occupano larghe regioni del cromosoma (10-100 Kb)
– Compatta unità genetica, spesso fiancheggiata da DRs, tRNAs, ISs
– Presenza di geni coinvolti nella mobilità
– Instabile, proni alla delezione
– Spesso codificano sistemi di secrezione (regione LEE in EPEC,
Spi1, Spi2 in Salmonella, Cag in H. pylori)
- Spesso codificano adesine, siderofori, tossine
(Enteropathogenic E. coli (Pai I, II, IV, V), Yersinia spp.
(HPI), V. cholerae (VPI or TCP-ACF element)
Sense environment
• Batteri possono avvertire cambiamenti nell’mbiente
– e.g. temperatura, disponibilità di nutrienti, osmolarità, densità
cellulare (“quorum sensing”).
• Nei casi più semplici, cambiamenti nella concentrazione
intracellulare di ioni sono direttamente legati
all’espressione genica
– e.g. fall in intra-cellular iron levels triggers de-repression of
diphtheria toxin gene
• Nei casi più complessi, sofisticate cascate di trasduzione
del segnale consentono al batterio di regolare l’espressione
di geni in risposta a cambiamenti ambientali
– the pathogen as an information processor
Switch virulence factors on and off
A multi-layered hierarchy
• Modificazioni nella sequenza
del DNA
– Amplificazione genica
– Riarrangiamento genico
• e.g. Hin flip-flop control of
flagellar phase variation
• Regolazione Transcrizionale
– Attivatori e Repressori
(helix-turn-helix motif)
– mRNA ripiegamento e stabilità
• Regolazione Translazionale
• Regolazione Posttranslazionale
– Stabilità delle proteine,
proteolisi controllata
– Modificazioni covalenti
• e.g. fosforilazioni in sistemi
a due-componenti sensoreregolatore
Swim
• Molti batteri patogeni
sono mobili
– Enterics, Campylobacter,
Helicobacter, spirochaetes
• Mobilità è cruciale per la
virulenza in alcuni casi
• Tipico organello di
motilità = flagello
• Varianti
– Twitching motility
– Swarming
Disseminazione
Enzimi batterici degradano differenti matrici tessutali. Sono
considerati INVASINE
• Ialuronidasi (streptococchi, staphylococchi, clostridi).
• Collagenasi (Clostridium histolyticum and Clostridium perfringens).
• Neuraminidasi (Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae).
• Streptochinasi and Stafilochinasi (streptococchi and stafilococchi)
Stick
• Conferisce al microrganismo capacità di resistere alla
rimozione meccanica operata sulle mucose e tropismo
tissutale
• Comuni meccanismi di aderenza
– Capsula e slime
– Biofilm
• Adesine Gram-positivi
– MSCRAMMs (microbial surface components
recognizing adhesive matrix molecules), e.g. protein A
– Fimbrie
• Adesine Gram-negativi (CHO and protein receptors)
– Fimbrie, Afimbrial adhesins (FHA, Pertactin etc.)
– Outer Membrane Proteins
– Types III-IV secretion
Colonizzazione
• La colonizzazione è la fase successiva all’adesione
e comporta la moltiplicazione batterica
• Espressione genica programmata: “quorum-sensing”
• Per moltiplicarsi, un batterio deve:
– trovare
un
ambiente
nutrizionale
favorevole
(temperatura, pH, scambi gassosi, osmolarità, nutrienti
essenziali, tra cui ferro)
– superare le difese dell’ospite
Biofilm
• Protezione in ambienti ostili (matrice eso-polisaccaridica)
• Organizzazione simil-tissutale:
– canali di nutrizione interni
– pattern di espressione genica diversi
• Alternanza di stati di vita comunitaria e vita planctonica
• Ruolo fondamentale dei flagelli e pili nelle prime fasi di adesione
(monolayer e microcolonie)
“structured community
of bacterial cells enclosed
in a self-produced
polymer matrix and
adherent to an inert or
living surface” (Costerton
et al., Science, 1999)
Biofilm sulla superficie di
un catetere
Biofilm sulla mucosa
ileale
Adesione batterica nel cavo orale e formazione della placca
Biofilm e infezioni
• Resistenti all’azione di anticorpi e fagociti.
• Naturalmente resistenti ad antimicrobici
• Causa frequente di infezioni croniche e persistenti,
soprattutto da parte di patogeni opportunisti:
–
–
–
–
–
–
P. aeruginosa e polmoniti in pazienti con CF
GAS e fascite necrotizzante
Streptococchi viridanti ed endocarditi
Streptococchi orali e carie
Batteri anaerobi orali e periodontopatie
Infezioni nocosomiali da S. epidermidis, S. aureus,
Actinomyces, Streptococcus
Scavenge nutrients
e.g. iron
• Livelli di Fe libero nei fluidi corporei è molto basso
– Reazioni inf. acute causano una ulteriore riduzione
– Sovraccarico di Fe aumenta suscettibilità alle infezioni
• I batteri possiedono vari meccanismi per ottenere Fe
– Siderofori chelano Fe disponibile e lo trasportano interno batteri
– Fe può essere ottenuto direttamente da proteine ospite in grado di legarlo
e.g proteine leganti la lattoferrina
– Alcuni patogeni evitano il problema riducendo la necessità di Fe, e.g.
Treponema pallidum
• Fe è utilizzato per regolare l’espressione di fattori di virulenza
– Tossina difterica (DtxR repressore)
– Shiga-like tossina
– Pseudomonas aeruginosa esotossina A
Survive Stress
• Oltre allo stress derivante dalla mancanza di nutrienti, I
patogeni devono affrontare molti altri stress
– Acidità nello stomaco
– Shock termico con la febbre
– Stress ossidativo nei fagociti
• Proteine prodotte in risposta a Stress, come le chaperonine,
appaiono degli antigeni immunodominanti
• Proteine con attività detossificante giocano un ruolo nella
virulenza, e.g. Cu,Zn-superossido dismutasi nello spazio
periplasmico
• Dose infettiva per patogeni enterici in pz con acloridria
Stealth
evitare (escape) il sistema immune
• IgA proteasi
– metalloproteasi attive contro IgA
• Proteine leganti le Immunoglobuline
– e.g. proteina A dello S. aureus
• Resistere all’azione del complemento, opsonizzazione
– Capsula (generalmente polisaccaridica)
– Lipopolisaccaride
– Proteine di superficie
• Mimicrismo antigenico
– e.g. capsula di acido sialico per il meningococco di
gruppo B
– Legame proteine ospite
• Variazione di fase o
antigenica
– Coinvolge strutture di
superficie come proteine,
LPS, capsula
– Varietà di meccanismi
• slip-strand mispairing
• flip-flop
• cassette
• Crescere in
– fagociti
– in biofilm
67700
67710
67720
GAAGTGCATTTAACTT**GGGGGGGGGGGTAAT
GAAGTGCATTTAACTT*GGGGGGGGGGGGTAAT
GAAGTGCATTTAACTTGGGGGGGGGGGGGTAAT
GAAGTGCATTTAACTT***GGGGGGGGGGTAAT
GAAGTGCATTTAACTT**GGGGGGGGGGGTAAT
GAAGTGCATTTAACTT****GGGGGGGGGTAAT
GAAGTGCATTTAACTT*GGGGGGGGGGGGTAAT
GAAGTGCATTTAACTT**GGGGGGGGGGGTAAT
GAAGTGCATTTAACTT***GGGGGGGGGGTAAT
GAAGTGCATTTAACTT***GGGGGGGGGGTAAT
GAAGTGCATTTAACTT***GGGGGGGGGGTAAT
GAAGTGCATTTAACTT**GGGGGGGGGGGTAAT
GAAGTGCATTTAACTT*GGGGGGGGGGGGTAAT
Homopolymeric tract in Campylobacter jejuni
Strategie usate dai batteri intracellulari
• Blocco maturazione fagosoma
(Legionella, Mycobacterium, Salmonella, Chlamydia)
• Adattamento e replicazione in compartimenti
lisosomiali
(Coxiella)
• Escape nel citosol
(Listeria, Shigella)
Patogeni extracellulari ed intracellulari
Shigella
Salmonella
Azione patogena dei batteri
• COLONIZZAZIONE dell’OSPITE
–
–
–
–
–
Adesione
Moltiplicazione batterica
Colonizzazione
Invasione
“Escape”/sovversione delle Difese Immunitarie
• DANNO DIRETTO all’OSPITE
– Produzione di tossine
– Produzione di molecole infiammatorie
– Reazioni autoimmunitarie
Opsonizzazione
Inibizione della fagocitosi
Inibizione della fagocitosi
Inibizione
dell’azione del
complemento
Azione patogena dei batteri
• COLONIZZAZIONE e MOLTIPLICAZIONE
nell’OSPITE
–
–
–
–
–
Adesione
Moltiplicazione batterica
Colonizzazione
Invasione
“Escape”/sovversione delle Difese Immunitarie
• DANNO TESSUTI OSPITE
– Produzione di tossine
– Produzione di molecole che inducono una risposta
infiammatoria
– Reazioni autoimmunitarie
MECCANISMI di
PATOGENICITA’ BATTERICA
Bacteria-induced toxicity
Host-mediated damage
MECCANISMI di
PATOGENICITA’ BATTERICA
Meccanismi di patogenicità indiretti
attraverso i meccanismi immuni adattativi
Immunità specifica ed
immunopatologia
• Infezioni acute
• Infezioni croniche
• tuberculosi
• lebbra
• sifilide
• Persistenza di detriti batterici nei tessuti
• Autoimmunità
Malattie autoimmuni legate a
mimicrismo antigenico
Tossine batteriche
Endotossine
Batteri Gram negativi:
rilascio LPS
Struttura del Lipopolisaccaride
• Porzione Polisaccaridica:
Antigen-O: antigenic properties,
highly variable polysaccharide which is
responsible for serologic diversity.
Core: conserved polysaccharide, divided
in two regions, outer-core and inner-core.
• Porzione lipidica:
Lipid A: allows LPS insertion into the
outermembrane and shows a similar
structure among different species.
Endotossine: effetti
•
•
•
•
Reazioni infiammatorie aspecifiche
Stimolano rilascio di citochine
Inducono attivazione del complemento
Sono mitogeni / attivatori policlonali per i linfociti B
• Agiscono come adiuvanti
• Pirogeni
Shock settico
• Ipotensione (tissue pooling of fluids)
• coagulazione intravascolare disseminata
• febbre
• insufficiente ossigenazione tessutale
• generalizzata insufficienza di organi
Sistemi dell’ospite partecipano alla
comparsa degli effetti tossici da
endotossine
 LPS binding protein (LBP)
 CD14: LPS receptor on PMNs/M
 Receptor for other cell types?
 Signal transduction? C3H/HeJ mice lps gene is
Toll-like receptor 4
 MD2?
 Transcription factor: NF-
 LPS inducible proinflammatory factors: TNF, IL-1,
IL-6/IL-8, NO, PAF, …
How does LPS signal cells?
Macrophage:
Endothelial cell:
LBP
LBP
Soluble CD14
LBP
CD14
LBP
How does LPS signal cells?
CD14 is a GPI-linked protein and cannot transmit a
signal across the plasma membrane.
CD14 must require a “co-receptor” capable of signaling.
How does LPS signal cells?
LPS signal transduction pathway
MyD88-dependent MyD88-independent
pathway
pathway
Bacteria
LPS
Linphocytes
+IFN
+IL2
+IL3
- IL4
Endothelial cells
Macrophages
IL 1
TNF
IL 6
Endothelial cells
Fibroblasts
PAF
Proteases
Free Radicals
Eicosanoids
PMN
IL-1
ICAM, ELAM
Effect of cytokines release
LPS
Macrophages/Endothelial
cells direct response
Primary mediators (IL1, IL6, TNFa)
Endothelial/Leukocytes molecular activation
Secondary mediators (NO, PAF, PG, LT, IL)
Vasodilatation, capillary leak, endothelial damage,
Reduced cardiac output, Respiratory failure,…
Effect of cytokines release
Genetic polymorphism and
variability in host response
Allelic variants Receptors:
• TLR4: D299G & T399I, 8% increased susceptibility to bacterial
infection (decreased risk atherosclerosis);
• TLR5: 392Stop, susceptibility to legionnaires disease;
• CD14: -159 C>T reduced expression of mCD14;
• NOD2: several mutations associated to reduced response to
LPS;
Allelic variants Effector molecules:
• TNFa: 308 A>G, 3,7-fold increase in mortality by sepsis.
• IL1ra: two copies intron 2 associated to 2.1-fold increase in
risk of severe sepsis.
Curr Opin Pulm Med, 2003
Endotoxins and Complement system
Endotoxins and Complement system
Homeostatsis of Coagulation cascade
is lost in Sepsis
In sepsis
sepsis the
coagulant
pathway is activated
(TFexposed
on
In
the extrinsic
anticoagulant
and profibrinolytic
mechanisms
are down
damaged endothelial
cells)
> resultant
thrombin procoagulant
release >> fibrin
deposition >>>
regulated
with a
state.
How to test for Endotoxins?
• Rabbit Pyrogen Test
– FD approved in 1941
• Cell based assays
– In Vitro pyrogen assay
• LAL Test
– gel clot LAL approved in 1973
– kinetic LAL in 1987
Rabbit Pyrogen Test
Measure the change in
temperature of 3 rabbits,
after intravenous
injection
of the test solution.
Cell based assays
Whole blood assay
Measure by ELISA the
LPS?
release of inflammatory
cytokines (IL-1, IL-6 and
TNFa) in the culture
supernatant of blood
mononuclear cells exposed
Secretion of cytokines
to test samples.
LAL
• Limulus - genus of Horseshoe Crab
• Amoebocyte - blood cells
• Lysate - blood extract
LAL is a FDA regulated biological that reacts
chemically in the presence of gram negative cell
debris. This reaction can be measured and
quantified.
LAL Testing
•
•
•
•
•
•
Gel Clot(Limit Test)
Gel Clot(Semi-Quantitative)
Endpoint Chromogenic
Endpoint Turbidimetric
Kinetic Chromogenic
Kinetic Turbidimetric
Horseshoe Crab
Horseshoe Crab
LAL Assay
• LAL is > 100 times more sensitive, specific and
accurate
• Economy of LAL permits more testing
• Tolerance of rabbits to endotoxin is a concern for
FDA
LAL activity correlates with pyrogenicity
Clotting Reaction For Activated LAL
Endotoxin
Pro-Clotting
Enzymes
Coagulogen
Clotting
Enzyme
M++ pH=7.2
Substrate
Coagulin Gel
Gel Clot LAL
Plus
Lowest reagent cost
Simple reporting (+/-)
Minus
Variability, subjectivity
Least sensitive
Good stability
Time consuming
Simple technique
Poor trending options
Sources of gel clot test problems
• Use of improper reaction or dilution tubes
• Incubating temperature too hot or too cold
• Improper dilutions
• Improper handling of lysate
Kinetic LAL Testing
Endotoxin
CLOT
CLOTTING CASCADE
coagulogen
proclotting enzyme
chromogenic substrate
coagulin
clotting enzyme
pNA
Kinetic LAL Advantages
• Quantitative results
• Higher throughput (96 wells)
• Lower sensitivity (to .001)
• Wider standard curve range
• Clear concise reporting
• Allows for data trending
Tossine batteriche
Domande
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Cosa si intende per microrganismo saprofita e parassita?
Quali forme di rapporto si possono instaurare tra un parassita ed il suo ospite
pluricellulare?
Quali sono i vantaggi che fornisce la flora microbica saprofitica del tratto GI al suo
ospite?
Quali sono i fattori che influenzano l’evoluzione dell’incontro tra un
microrganismo ed un ospite pluricellulare?
Quali sono le principali vie di infezione?
Quali sono i meccanismi di difesa aspecifici di cui è dotato un organismo
pluricellulare per controllare la popolazione microbica presente su cute e mucose?
Quali i meccanismi di difesa specifici di cui siamo dotati per neutralizzare i
microrganismi?
Cosa si intende per carica infettante?
Cosa si intende per virulenza di un microrganismo e da cosa è determinata?
Descrivere le varie fasi nello sviluppo di una infezione
Adesione batterica: significato e strutture coinvolte
Colonizzazione: significato e modalità di colonizzazione per i vari distretti corporei
Biofilm: struttura, significato biologico ed importanza per processi infettivi
14. Meccanismi di disseminazione batterica
15. Meccanismi di escape dalla risposta immunitaria
16. Cosa si intende per Patogeni intracellulari e quali le strategie usate da questi batteri
17. Meccanismi di patogenicità batterica diretti ed indiretti
18. Endotossine batteriche: struttura, meccanismo d’azione ed effetti nell’ospite
19. Caratteristiche generali delle esotossine
20. Tipi principali di esotossine
21. Tossine con target extracellulare
22. Esotossine tipo I: tossine che agiscono sulla superficie cellulare
23. Esotossine che danneggiano la membrana cellulare
24. Cosa sono e quale è la struttura/meccanismo d’azione delle emolisine
25. Determinanti genetici delle esotossine batteriche con esempi
26. Esotossine con target intracellulare: descriverne il meccanismo d’azione
27. Esotossine con target intracelulare: descriverne la organizzazione molecolare
28. Esotossine con target intracellulare: descrivere tipo di attività enzimatica catalizzata
29. Esotossine batteriche: tossina colerica (struttura e meccanismo d’azione)
30. Esotossine batteriche: tossina antrace (struttura e meccanismo d’azione)
31. Esotossine batteriche: tossina difterica (struttura e meccanismo d’azione)
32. Esotossine batteriche: tossine botulinica e tetanica (struttura e meccanismo d’azione)
33. Tossine di tipo IV: inoculate nella cellula bersaglio
34. Applicazioni biotecnologiche tossine batteriche
35. Cosa sono le infezioni opportunistiche e quale la loro rilevanza