Torino, 21 Settembre 2010
Valorizzazione di prodotti lattiero-caseari
piemontesi: approcci molecolari per lo
studio dell’ecosistema microbico
Luca Cocolin
Di.Va.P.R.A., Microbiologia Agraria e Tecnologie Alimentari
Università di Torino
E-mail: lucasimone.cocolin@unito.it
Fermentazioni naturali come fonte di
biodiversità microbica
L’Italia è un paese estremamente ricco di prodotti tipici artigianali, le cui tecniche di
produzione si tramandano di padre in figlio senza nessuna traccia scritta. La maggior
parte di questi prodotti sono il risultato di un complesso processo di trasformazione
microbica che molto spesso è eseguito da microrganismi naturalmente presenti
nelle materie prime. Da questo punto di vista rappresentano dei patrimoni unici da un
punto di vista della biodiversità microbica.
Solo in Piemonte:
- 369 Prodotti Artigianali Tipici (PAT,
Regolamento della Regione Piemonte n.
173/98 e 350/99)
- 12 Prodotti di Origine Protetta (DOP) e 5
Prodotti ad Indicazione di Orgine Protetta
(IGP) (Regolamento Europeo n. 510/2006)
Approcci sperimentali per lo studio dell’ecologia microbica
Fermented food
Cultured
bacteria
Total bacteria
FISH analysis
Molecular
identification
PCR and RTPCR
amplification
Phenotypic
characterization
Clone library
cloning and
sequencing
Pattern analysis
DGGE, TGGE,
SSCP
Bacterial diversity and activity,
ecology and phylogeny data
Molecular
characterization
Non-PCR based
methods
PFGE
PCR-based
methods
RAPD, Rep,
Sau-PCR
Culture-dependent methods
Culture-independent methods
Isolation
DNA and RNA
extraction
Significato dei target molecolari utilizzati
nelllo studio dell’ecologia microbica
RNA
DNA
Diversità
Attività
Stati vitali non culturabili?
Approcci innovativi per la ricerca di produttori di batteriocine (Poster 17)
Studio dell’ecologia microbica
Progetto Regione Piemonte: CIPE 2006, BIOPRO
159 COLONIE
alone di inibizione
19 COLONIE
42 COLONIE
alone di inibizione =
no riconferma alone
ACIDITA’
di inibizione
98 COLONIE
alone di inibizione =
BATTERIOCINE
- 56 colonie inibiscono più di un ceppo
patogeno (++ S. aureus e L.
monocytogenes)
- 42 colonie inibiscono un solo ceppo
patogeno (++ Listeria monocytogenes)
Replica plating®
Salmonella enteritidis O:103
Escherichia coli O157:H7
Staphylococcus aureus ATCC® 6538™
Listeria monocytogenes 4b
Clostridium tyrobutyricum DSM 2637
Brochotrix thermosphacta ATCC® 11509™
Approcci innovativi per la ricerca di produttori di batteriocine (Poster 17)
Dopo identificazione molecolare
55 ceppi di lattococchi, di cui:
- 32, Lactococcus lactis
- 13, Lactococcus lactis subsp. cremoris
- 10, Lactococcus lactis subp. lactis
43 ceppi di enterococchi, di cui:
- 32, Enterococcus faecium
- 8, Enterococcus faecalis
- 3, Enterococcus spp.
L. lactis
L. lactis subsp. lactis
L. lactis subsp. cremoris
E. faecium
Enterococcus spp.
E. faecalis
Nisina A
10
0
0
Nisina Z
21
0
11
LcnB
Lct481
4
0
2
1
0
0
Batteriocine
LcnGα/β
3
0
0
Batteriocine
Enterocina A Enterocina P Ent A/Ent P
21
5
4
1
2
1
0
0
0
LcnQα/β
3
0
0
NisA/NisZ NisA/Lcn481 Nis Z/LcnB
7
1
0
0
0
0
0
0
1
Cytolisina
10
1
7
Batteriolisine
Enterolisina A Citol/EnterolA
10
10
0
0
5
5
Metodi coltura indipendenti per lo studio dell’ecologia microbica in prodotti
tradizionali: il Castelmagno DOP (Poster 65)
Metodi coltura indipendenti per lo studio dell’ecologia microbica in prodotti
tradizionali: il Castelmagno DOP (Poster 65)
???
Sviluppo di starter autoctoni per prodotti caseari tradizionali: la Toma piemontese
(Poster 18)
L. lactis subsp. lactis
100%
Ceppi
selezionati
90%
80%
70%
Leuconostoc lactis
Lactococcus garvie
60%
Leuconostoc mesenteroides
Lactobacilus plantarum
Enterococcus gallinarum
Lactococcus lactis
subsp.cremoris
Enterococcus durans
Streptococcus parauberis
Lactococcus lactis
subsp. Lactis
50%
Lactobacillus paracasei
Enterococcus faecalis
40%
30%
Streptococcus sp.
20%
10%
0%
LATTE
CAGLIATA
FORMAGGIO
L. lactis subsp. cremoris
Ceppi
selezionati
Conclusioni
• I metodi molecolari possono essere utilizzati utilmente per
una miglior comprensione della biodiversità microbica e per
lo studio della complessità ecologica in prodotti lattiero
caseari
• Alcuni concetti relativi alla funzione dei microrganismi
durante le fermentazioni casearie devono essere
riconsiderati ed è necessario investire in termini di ricerca
scientifica a tale scopo
• La validazione della capacità degli starter microbici di
condurre i processi trasformativi diventa fondamentale nel
caso di ceppi autoctoni
• Lo studio delle ecologie microbiche deve essere condotto
mediante un approccio multifasico in cui diverse metodologie
si devono integrare per poter produrre una “fotografia” il più
vicina possibile alla realtà !
Ringraziamenti
• DIVAPRA:
- Kalliopi Rantsiou, Paola Dolci, Valentina Alessandra, Barbara
Dal Bello, Marta Bertolino, Giuseppe Zeppa
• I partner di ricerca:
-
UNITO (Dipartimento di Biologia Animale e dell’Uomo,
Dipartimento di Patologia Animale), Istituto Zooprofilattico
Sperimentale della Liguria, Piemonte e Valle d’Aosta,
UNIPM (Dipartimento di Scienze Chimiche, Alimentari,
Farmaceutiche e Farmacologiche)
-
Le aziende lattiero casearie
- Regione Piemonte per il sostegno economico
Grazie per l’attenzione !!!
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approcci molecolari per lo studio dell`ecosistema microbico