Genetica medica
ADI-1
genetica online e clinica
[email protected]
Dip. di Genetica Biologia e Biochimica
Genetica medica oncologica
ASO S. Giovanni Battista - Torino
IRCC - Candiolo
Le malattie genetiche :
Malattie causate in modo esclusivo o
parziale da un difetto del patrimonio
ereditario:
•
difetto nel numero o struttura dei cromosomi
-> malattie cromosomiche
•
difetto nella struttura o funzione di un gene
-> malattie geniche (monogeniche)
(mutazioni del DNA nucleare e mitocondriale)
•
coinvolgimento di una serie di geni localizzati in
una stessa regione genomica (riarrangiamento)
-> malattie genomiche
Le malattie genetiche :
•
effetto di modificazioni chimiche e strutturali del
DNA in grado di alterare l’espressione di un gene o
di un gruppo di geni
-> malattie epigenetiche
(difetti di imprinting)
•
effetto dell’interazione tra geni e ambiente
-> malattie multifattoriali o complesse
+ 179
March 20, 2005
+ 186
March 24, 2004
April 19, 2006
March 20, 2005
March 24, 2004
77
74
73
35
21/03/2005
53
51
46
18
Feocromocitoma 13
Feocromocitoma 13
48
1
2
1
13
Feocromocitoma 13
76
Sede ignota 76
2
2
80
81
82
2
65
78
1
71
31
Angioma 31
21
44
Feocromocitoma 43
Feocromocitoma 43
14
11
Perché occuparci di questi casi da un
punto di vista genetico ?
• tumori giovanili, multipli, bilaterali fanno sospettare una
predisposizione
diagnosi
• i soggetti già malati potrebbero sviluppare altri tumori
• altri membri della famiglia potrebbero ammalarsi
• parenti sani ma preoccupati di potersi ammalare in
futuro potrebbero non avere ereditato il difetto genetico
corretta
gestione clinica
identificazione
dei portatori
identificazione
dei non portatori
• la “causa” genetica (biochimica) di una malattia potrà in futuro
essere corretta ?!
ricerca
Ricerca basata sul “sintomo”
Feocromocitoma famigliare
Feocromocitoma + angioma midollare
• National Center for Biotechnology Information
NCBI : http://www.ncbi.nlm.nih.gov
– Pubmed , OMIM
– > VHL, RET, SDH-B, SDH-C, SDH-D
• Gene Test
http://www.geneclinics.org/
– > Gene Review
• Cancer Prone Diseases
http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/
MEN2
MEN1
parathyroid
hyperplasia
medullary
thyroid carcinoma
pheochromocytoma
paraganglioma
neuroendocrine
pancreatic tumors
retinal angiomas
CNS haemangioblastomas
renal cell carcinomas
pituitary adenoma
duodenal gastrinomas
carcinoids exc.
VHL
SDH genes
Predisposizioni ereditarie allo sviluppo del
feocromocitoma
e paragangliomi extra-surrenalici
Casi di feocromocitoma
isolato , non-sindromico
(surrenalico , extra-surrenalico)
– 11% VHL (per lo più mutazioni missenso)
– 5% RET (per lo più mutazioni esoni 11 e 13)
– 4.5% SDHB
– 4% SDHD
Tot 24%
(70% <10 yr, 51% < 20 yr; 39% < 30 yr, 27% < 40 yr, 18% < 50 yr)
(80% se multifocale)
76
Sede ignota 76
2
2
80
81
82
2
78
Paziente di anni 43.
- a 42 anni: feocromocitoma bilaterale
- non altre manifestazioni cliniche di VHL
(fondo oculare negativo,
1
RM encefalo e midollo negativa,
TC addome negativa)
Genitori deceduti:
- madre a 71 anni per emorragia cerebrale
- padre a 65 anni per coma diabetico
Una sorella deceduta a 31 anni
per complicanze post-operatorie di intervento
neuro-chirurgico per “angioma midollare”.
65
71
31
Angioma 31
21
44
Feocromocitoma 43
Feocromocitoma 43
14
11
Impostazione del test genetico
• Ricerca di mutazioni e delezioni gene VHL
• Se negativo,
– analisi RET e SDH-B, SDH-C, SDH-D
Acquisizione della sequenza genomica del
gene VHL
(Entrez Gene, Ensemble: www.ensembl.org)
- ricerca di mutazioni puntiformi: PCR e sequenza
- ricerca di delezioni genomiche
PCR
Denaturazione 95°C
Appaiamento inneschi
Sintesi del DNA 72 °C (Taq polimerasi)
Ciclo 1
Appaiamento
inneschi
Sintesi del DNA
Ciclo 2
PCR :
Reazione a Catena della Polimerasi
N° cicli
N° sequenze bersaglio
1
0
3
2
10
256
15
8192
20
262.144
25
8.388.608
30
268.435.456
Per l’analisi di una digestione con enzimi di restrizione tale da poter essere visibile in elettroforesi occorre
~1g di DNA. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10-12g) allora ~1 g of DNA potrebbe essere
isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni.
In 1  g di DNA genomico, una copia singola di un esone (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA.
Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8  g in 25 cicli e 27  g in
30 cicli.
Sequenziamento del DNA (1):
strutture dei nucleotidi
Sequenziamento del DNA (2):
il metodo di Sanger
Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato
in 4 pozzetti separati di un gel di poliacrilammide
* Indica il primer (lungo 15 nucleotidi)
** I dNTP sono ad una concentrazione 100 volte superiore di quella dei ddNTP
in ciascuna provetta
Sequenziamento del DNA (3):
il metodo di Sanger
pozzetti
autoradiogramma
Si legga la sequenza man mano sintetizzata dal basso verso l’ alto.
Il nucleotide G è il più vicino al primer (estremità 5’)
mentre il nucleotide T è all’estremità 3’.
361G>A
Caso indice: sequenza “senso” (forward)
Caso indice: sequenza “anti-senso” (reverse)
541 CACAGCTACCGAGGTCACCTTTGGCTCTTCAGAGATGCAGGGACACACGATGGGCTTCTG
110 -H--S--Y--R--G--H--L--W--L--F--R--D--A--G--T--H--D--G--L--L-
codifica mutazione c.365G>A (p.D121N)
GAT>AAT: Asp121Asn
Acido Aspartico
->
aa acido
COOH
Asparagina
aa polare
COOH
|
2HN -- CH
|
2HN -- CH
|
CH2
|
CH2
|
|
COOH
CO--NH2
DB SNPs:
Segnalato in precedenza SNP
D121G senza info
DB mutazioni:
The Human Gene Mutation Database :
http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html
-> report 1994 D121G in un paz. con feocromocitoma
VHL protein
beta-domain
Linker: aa 189-194
7 stranded b sandwich:
aa 63-154
(HIF1a binding: aa 67-117)
H4: aa 193-204
alpha-domain
aa 155-192
H1 – H2 – H3
Linker: aa 154-156
polar interface
between a and b domains
Stebbins CE et al Science 1999
VHL – a b interface
Polar interface between alpha and beta domain
Hydrogen bonds involving:
a amino acids:
H3
Asp187, Leu188
H1
Glu160, Arg161, Gln164, Arg167
b amino acids:
L6
Asp121, Thr124, Asp126
L2
Arg82
Stebbins CE et al Science 1999
77
53
51
74
73
46
18
Feocromocitoma 13
Feocromocitoma 13
48
35
1
2
1
13
Feocromocitoma 13
Feocromocitoma non sindromico
giovanile in due fratelli
Programma:
- ricerca di mutazioni RET e SDH
- se negativo: analisi VHL
77
53
51
74
73
46
48
35
1
2
1
21/03/2005
18
Feocromocitoma 13
Feocromocitoma 13
13
Feocromocitoma 13
79
55
53
74
73
48
20
Feocromocitoma 13
Feocromocitoma 13
50
Feocromocitoma 49
Feocromocitoma 50
Angiomi retinici 50
15
Feocromocitoma 13
35
1
2
1
467A>C
Caso indice
Madre
661 AATATCACACTGCCAGTGTATACTCTGAAAGAGCGATGCCTCCAGGTTGTCCGGAGCCTA
150 -N--I--T--L--P--V--Y--T--L--K--E--R--C--L--Q--V--V--R--S--L-
codifica mutazione c.467A>C (p.Y156S)
TAT>TCT: Tyr156Ser
Tirosina
->
aa idrofobico aromatico
COOH
polare
|
2HN -- CH
|
Serina
aa polare “sottile”
COOH
|
2HN -- CH
|
CH2
|
CH2--OH
|
OH
DB SNPs:
NON segnalati SNPs in 156
DB mutazioni:
The Human Gene Mutation Database :
http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html
-> 3 report anche recenti di mutazioni: Y156D, Y156N, Y156C
VHL - Elongin C interface
Most relevant contact: Leu158 – Cys162 – Arg161
Hydrogen bonds: Arg82 – Arg161 – Lys159
Stebbins CE et al Science 1999
Effetto delle mutazioni missenso
•
•
•
•
cambiamento aminoacidico +- conservativo
frequenza nella popolazione generale
segregazione nell’ambito della famiglia
effetto prevedibile sulla struttura/funzione
della proteina (modeling)
• conservazione nell’evoluzione
• test funzionale (ev. second hit)
SIFT
Sorting Intollerant From Tollerant
http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html
D121N con nematodi
senza nematodi
0.13
0.00
Y156S con nematodi
senza nematodi
0.26
0.22
Y156D con nematodi
senza nematodi
0.13
0.11
Y156N con nematodi
senza nematodi
0.20
0.17
Y156C con nematodi
senza nematodi
0.11
0.09
Inattivazione di geni onco - soppressori :
perdita di funzione
Geni RECESSIVI
entrambi gli alleli inattivati :
• delezioni o riarrangiamenti
cromosomici
• mutazioni puntiformi
• iper - metilazione
2 mutazioni somatiche
1 costituzionale + 1 somatica
tumore sporadico
tumore ereditario
Gene onco-soppressore Rb
Rb
Rb
Rb
Rb
Alleli Rb normali
Rb
Mutazione germinale
mutazione somatica
mutazione somatica
Retinoblastoma unico
mono-laterale
mutazione somatica
Retinoblastomi
multipli bilaterali ad
insorgenza precoce
Inattivazione di geni onco - soppressori
con perdita di eterozigosità (LOH)
Prima mutazione:
puntiforme
seconda mutazione:
delezione
Allele
Allele
1
5
8
2
3
6
Allele
Allele
1
5
8
2
3
6
Allele
Allele
8
2
3
6
Inattivazione di geni onco - soppressori
con perdita di eterozigosità (LOH)
Tessuto
sano
Allele
3
1
5
8
Allele
3
2
3
6
Allele
1
4
6
8
Allele
3
2
3
6
Allele
5
3
4
6
Allele
3
2
3
6
Allele
Allele
3
2
3
6
Allele
1
Allele
3
2
3
6
Allele
5
3
Allele
3
2
3
6
Tessuto
tumorale
8
Loci studiati:
Caso 1
Caso 2
Caso 3
8
1
ni
+
+
2
+
3
-
4
+
+
ni
Sede del gene onco-soppressore