Citogenetica 2
La citogenetica e` lo studio dei fenomeni genetici attraverso l’analisi citologica
dei cromosomi al microscopio.
Ferguson-Smith
Lezione 2
Analisi del cariotipo
1) Allestimento della coltura
2) Preparazione dei vetrini
3) Colorazione del preparato con
colorazioni differenziali di routine
4) Osservazione al microscopio, selezione
delle metafasi e acquisizione delle immagini
Allestimento del preparato
fitoemoagglutinina
(stimola la crescita)
colchicina
(ultimi 30’)
Ipotonica (20’)
sangue
periferico
proliferazione
centrifugazione
centrifugazione
48-96h
terreno di
coltura
fissativo
pellet
risospeso
pellet
risospeso
fissativo
centrifugazioni (2-3)
risospensione
in poco
fissativo
allestimento del
preparato
Analisi del cariotipo
1) Allestimento della coltura
2) Preparazione dei vetrini
3) Colorazione del preparato con
colorazioni differenziali di routine
4) Osservazione al microscopio,
selezione delle metafasi e acquisizione
delle immagini
Metodi colorazione differenziale
Colorano una regione specifica di alcuni o
di tutti i cromosomi
C-bande : tutti i centromeri e le regioni eterocromatiche variabili
dei cromosomi 1,9,16,Y
Creano un’alternanza di bande chiare e
scure lungo l’asse del cromosoma
specifica per ogni coppia di omologhi.
Cariotipi a confronto
1-3 gruppo A
4-5 gruppo B
X-6-12 gruppo C
13-15 gruppo D
19-20 gruppo F
16-18 gruppo E
Y-21-22 gruppo G
QM-banding pattern
utilizzando la mostarda di quinacrina......
DAPI e QM
C-bande
G-bande
HSA1
HSA14
G
QM
G
QM
R-bande
Analisi del cariotipo
1) Allestimento della coltura
2) Preparazione dei vetrini
3) Colorazione del preparato con
colorazioni differenziali di routine
4) Osservazione al microscopio,
selezione delle metafasi e acquisizione
delle immagini
 Ottima
ma…..
by GP&NA
 Puo’
essere
anche
cosi’...
Cromosomi non
ben riconoscibili,
difficili anche da
contare.
Scartare! (potendo)
by GP&NA
 .. O cosi’
 Troppo contratti
pero’ si puo’ usare
per contarli.
Scartare! (potendo)
by GP&NA
Selezione delle metafasi
Sufficiente
 Si possono contare
Puo’ essere utile per
analizzare i cromosomi
non sovrapposti
by GP&NA
Selezione delle metafasi
Discreta
 Si possono
contare, e anche
se ci sono alcune
sovrapposizioni,
si possono
analizzare
by GP&NA
 Buona
 Si possono
contare, e anche
se ci sono alcune
sovrapposizioni,
la morfologia dei
cromosomi e’
buona
by GP&NA
Selezione delle metafasi
Come si fa il cariotipo?
1. SI CONTANO I CROMOSOMI : IMPORTANTE PER
SOSPETTARE LA PRESENZA DI ALTERAZIONI NEL
NUMERO CROMOSOMICO
2. SI APPAIANO GLI OMOLOGHI PER SIMILARITA’
3. SI METTONO IN ORDINE SECONDO LA CONVENZIONE
by GP&NA
Fare il cariotipo
46
10
9
11
by GP&NA
16
Cariotipo ordinato
CARIOTIPO IN QM (indicare il bandeggio)
by GP&NA
Diagramma
46,XX - cariotipo normale Femminile
Terminologia
46,XY - cariotipo normale Maschile
Questo modo di scrivere ci da’ due informazioni:
- numero totale dei cromosomi (46)
- sesso dell’organismo
47,XY,+21
Maschio con 47 cromosomi (invece di 46)
ed un cromosoma 21 in piu’ (sindrome di Down)
46,XX,del(14)(q23)
46,XY,dup(14)(q22q25)
46,XX,r(7)(p22q36)
del=delezione
dup= duplicazione
r=ring (cromosoma ad anello)
cromosoma
sul vetrino
FISH
sintesi di una sonda complementare
marcata con un fluorocromo
denaturazione
doppia elica
di DNA
AT C GGTATC C TA
TAGG C ATAG G AT
AT C GGTATC C TA
TAGG C ATAG G AT
AT C GGTATC C TA
TAGG C ATAG G AT
A
denaturazione
AT C GGTATC C TA
TAGG C ATAG G AT
TAGG C ATAG G AT
ibridazione della sonda sui
cromosomi denaturati
sul vetrino
AT C GGTATC C TA
TAGG C ATAG G AT
osservazione
del vetrino
Principio della fluorescenza
FISH : microscopio a fluorescenza


Osservazione
al microscopio
filtro di emissione
filtro di eccitazione
Lampada a vapori
di mercurio
CCD camera


Elaborazione al
computer
obiettivo/
condensatore
by GP&NA
fotografia
FISH: metafase in DAPI
Cromosomi
1. denaturati
2. colorati con DAPI
by GP&NA
FISH: segnali
Sonde puntiformi
fluorescenti
FISH: merge
Sovrapposizione
dell’immagine della
sonda
sull’immagine del
DAPI
SONDE PER FISH
WCP
DAPI
MERGE
SONDA
PCP
DAPI
MERGE
SONDA
SONDE PUNTIFORMI
BAC chr1
BAC chrX
COIBRIDAZIONE DI 3 SONDE
COIBRIDAZIONE DI 2 SONDE
PUNTIFORMI
PUNTIFORMI
COIBRIDAZIONE DI 2 SONDE
PUNTIFORMI CON WPC